- 姜一峰;周艳君;田志军;安同庆;肖燕;韦天超;王瑜;彭金美;于海;李国新;闫丽萍;张善瑞;童光志;
通过对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,HP-PRRSV)HuN4株亲本毒及其不同代次传代毒株Nsp2(Nonstndural protein2)蛋白氨基酸序列比较分析,发现不同代次的Nsp2蛋白存在4处氨基酸点突变,针对每个突变点分别人工合成编码短肽的核苷酸序列,经原核表达后进行Western blot分析。结果表明表达的融合蛋白F65-11(749KGEPVSDQPAK759)能够特异性的与HuN4-F40、HuN4-F65和HuN4-F112感染猪的血清发生反应,而与HuN4F5感染猪的阳性血清和CH-1a株阳性血清不发生反应,证实第4个氨基酸点突变(S754)处存在一个免疫优势抗原表位。将该表位肽段由N端和C端逐步缩短继续鉴定,当N端缩短到第5个氨基酸(754SDQPAK759)C端缩短到第3个氨基酸(749KGEPVSDQ757)时,表达的融合蛋白不能与PRRSV阳性血清反应,最终推测该抗原表位必需氨基酸为753VSDQ756。选取GenBank中提交的部分高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的Nsp2氨基酸序列,对该表位氨基酸所在位置进行序列比较,分析结果显示位于Nsp2蛋白749→759位氨基酸序列高度保守,F65-11变异位点C754→S754为HuN4株系列传代毒株所特有。本研究结果证实抗原表位F65-11可以作为鉴别HuN4-F112弱毒疫苗所诱导产生的特异性抗体的候选抗原。
2009年03期 v.17;No.71 1-7页 [查看摘要][在线阅读][下载 606K] [阅读次数:140 ] |[下载次数:262 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:3 ] - 闫丽萍;华荣虹;亓文宝;周艳君;李国新;于海;姜一峰;童光志;
流行性乙型脑炎(Japanese Encephalitis,JE)是一种人与动物共患的虫媒病毒性疾病,严重危害着人畜的健康。E蛋白是乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)的主要结构蛋白,在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。为了确定该蛋白的抗原优势区域,本研究设计了3对引物,将E蛋白分成3个大段,分别是EF1(1~291aa)、EF2(292~402aa)和EF3(403~500aa),又将EF1分成4个相互重叠的小片段,分别是EF1-1(1~88aa)、EF1-2(68~155aa)、EF1-3(129~222aa)和EF1-4(202~291aa),将以上基因片段分别克隆到原核表达载体进行GST融合表达。SDS-PAGE电泳鉴定各融合蛋白均获得表达,各表达产物以包涵体的形式存在。通过Western blot分析表明融合蛋白GST-EF1、GST-EF2、GST-EF1-1、GST-EF1-2、GST-EF1-3和GST-EF1-4均能被阳性血清识别。通过ELISA鉴定,GST-EF2反应性最强,GST-EF1反应性比GST-EF2稍弱,而GST-EF3反应性最弱,GST-EF1-1、GST-EF1-2、GST-EF1-3和GST-EF1-4片段融合蛋白反应性与GST-EF1相似。由此本研究鉴定出1~402aa是E蛋白的抗原优势区域,在此区域内包括了12个Cys的保守区及域Ⅰ、域Ⅱ和域Ⅲ3个主要抗原域。E蛋白抗原优势区域的鉴定,为E蛋白抗原表位的鉴定以及针对于E蛋白诊断试剂的开发奠定了基础。
2009年03期 v.17;No.71 8-13页 [查看摘要][在线阅读][下载 266K] [阅读次数:183 ] |[下载次数:137 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:13 ] - 孙永科;杨玉艾;孔令富;毕保良;冷春永;冷思明;
从云南10个地州13个大型猪场采集到的17份样品中分离得到5株猪瘟病毒。经测序鉴定昆明、玉溪、曲靖地区分离株的核苷酸序列99.99%同源,大理和宝山地区的核苷酸序列99.99%同源,5株分离毒均属于基因二群。5株分离毒在PK-15细胞上的平均毒价约为2×106TCID50/mL,应用荧光抗体染色可以检测到CSFV。通过RT-PCR扩增猪瘟病毒约1 200bp和700bp的E2和E0蛋白全部抗原编码区序列,并将其分别克隆到pMD18-T载体中。序列分析结果表明,5株分离株的E0和E2基因片段为697bp和1 173bp,与猪瘟病毒Shimen株的核苷酸同源性仅为95.4%和96.6%、82.5%和84.3%,与C-株的核苷酸同源性分别为94.1%和95.2%、83.3%和85.4%。动物试验结果表明,分离的2株猪瘟野毒不能引起典型的猪瘟症状,但是能持续带毒。
2009年03期 v.17;No.71 13-20页 [查看摘要][在线阅读][下载 523K] [阅读次数:116 ] |[下载次数:257 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:7 ] - 许傲天;周艳君;李国新;于海;闫丽萍;陈宗艳;张善瑞;王礞礞;姜一峰;王亚欣;田志军;童光志;
根据GenBank中已发表的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly Pathogenic Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)HuN4株全基因组序列,设计合成一对引物,对PRRSV HuN4株非结构蛋白Nsp4(Nonstructural protein4基因进行RT-PCR扩增,克隆到原核表达载体pET30a(+)中,构建重组表达载体pET30a-Nsp4,经酶切测序鉴定。将pET30a-Nsp4转化表达菌株BL21(DE3),诱导可表达分子量约为27kDa重组蛋白。Western blot显示其具有较好的反应原性,经镍离子亲和层析(Ni-NTA)纯化获得了高纯度的可溶性重组蛋白。将纯化的Nsp4蛋白免疫BALB/c小鼠,抗血清ELISA效价达1∶16 000,Western blot和IFA表明,所制备的抗血清能够特异性识别PRRSV自身表达的Nsp4蛋白。本研究获得了可溶性的PRRSV Nsp4蛋白,制备了Nsp4特异性多抗血清,为进一步研究Nsp4蛋白的亚细胞定位及功能奠定了基础。
2009年03期 v.17;No.71 21-26页 [查看摘要][在线阅读][下载 264K] [阅读次数:135 ] |[下载次数:173 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:2 ] - 郭伟;商晓桂;单同领;华修国;杨志彪;朱建国;周雨霞;
为研究上海地区犬感染细小病毒(Canine parvovirus,CPV)的基因特点和基因型,参考GenBank上细小病毒3个基因型的全基因设计6对扩增引物进行PCR,分段扩增出目标片段,克隆于T载体上,测定序列并拼接,用MEGA软件、NJ法构建进化树。结果显示,犬细小病毒全基因为4 758bp,命名为CPV-SH,提交到GenBank上的序列号为FJ792845,与GenBank中4种基因型犬细小病毒的VP2基因核苷酸序列同源性比较发现,CPV-SH克隆与2a亚型犬细小病毒核苷酸同源性为最高99.7%,与2型、2b亚型、2c亚型的同源性分别为98.8%、99.5%、99.5%。CPV-SH属于2a亚型犬细小病毒,与国内北京分离株CPV/BJ082亲缘关系最近,同源性为99.9%。
2009年03期 v.17;No.71 27-32页 [查看摘要][在线阅读][下载 323K] [阅读次数:141 ] |[下载次数:529 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:18 ] - 吴晓平;钱琨;沈海玉;王平平;邵红霞;金文杰;秦爱建;
对江苏商品蛋鸡6个鸡场临床表现严重血管瘤鸡群的送检样品进行了病理学分析,结果发现,送检的6只商品蛋鸡均可见体表血管瘤,内脏主要在肝、脾、肌胃和肠系膜表面的大小不等的血管瘤,引起严重的肝破裂、脾脏失血和肌胃失血,6个病例中有4个病例出现血管瘤和髓样细胞瘤并存。追踪检测父母代蛋鸡表明,父母代蛋鸡场的各个日龄鸡群均存在不同程度的丁亚群禽白血病病毒(Avian Leukosis Vivus Subgroup J,ALV-J感染;而送检商品病鸡均呈现病毒血症而抗体阴性,提示垂直传播的可能;ALV-J特异性RT-PCR结果显示,6个样品均存在ALV-J感染;对扩增克隆的部分序列分析可见,此六株病毒之间同源性为97.9%~99.6%,而与原型毒HPRS103之间的同源性则较低(94.6%~95.2%),与同为蛋鸡分离毒株AY360088和SD07LK1同源性为94.2%~95.0%。
2009年03期 v.17;No.71 33-39页 [查看摘要][在线阅读][下载 520K] [阅读次数:113 ] |[下载次数:220 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:23 ] - 张明明;钱琨;王小辉;秦爱建;
为了解A型禽腺病毒在家禽中的分布情况,从不同地区外表健康家禽中采集泄殖腔拭子,根据鸡胚致死孤儿病毒(Chicken Embryo Lethal Orphan Virus,CELOV)的全基因组序列设计引物,采用PCR方法扩增了禽腺病毒(Fovl Adenoviruses,FAV)病毒基因组右末端ITR片段和ORF8片段。结果表明:A型禽腺病毒在家禽中分布比较广泛,鸡群、鸭群和鹅群的阳性率分别为23.8%、51.7%和17.2%。ITR片段扩增产物测序结果表明,禽腺病毒分离株与A型禽腺病毒CELOV、FAV-JS株在ITR片段具有很高同源性,而与FAV-9、火鸡腺病毒A型和鸭腺病毒A型的同源性较低。ORF8片段扩增产物测序结果表明,分离株的ORF8的序列与CELOV、FAV-JS株的ORF8片段也具有高度同源性。
2009年03期 v.17;No.71 39-44页 [查看摘要][在线阅读][下载 318K] [阅读次数:126 ] |[下载次数:374 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:8 ] - 宋翠萍;贾雪波;陈鸿军;于圣青;丁铲;
本试验收集了临床发生黄疸病犬的尿液,提取基因组DNA,经16s rRNA基因PCR鉴定,表明该犬存在钩体黄疸出血群毒株感染。以该基因组DNA为模板,扩增获得lipL32基因,并对该基因进行了原核表达,结果显示该抗原在大肠杆菌中获得高效可溶性表达。该蛋白的成功制备为犬钩体的诊断及新型亚单位疫苗的研制提供了广谱候选抗原。
2009年03期 v.17;No.71 44-48页 [查看摘要][在线阅读][下载 236K] [阅读次数:150 ] |[下载次数:86 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] - 李婧;朱瑞良;李舫;刘敬盛;提金凤;
从山东某地市典型鸭传染性浆膜炎病例中分离得到8株细菌,经过形态与培养特性观察、生化试验、PCR等方法鉴定为鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA),血清型鉴定发现其中的4株为血清3型,其余4株未定型。血清3型WC6株对雏鸭的致病性试验表明,含菌量约为3×109CFU/mL的菌悬液,对10日龄雏鸭有较强的致病性,感染后症状典型,死亡明显;法氏囊指数低于对照组,差异显著(P<0.05);脾脏指数、胸腺指数都高于对照组,但差异不显著(P>0.05);病理组织学变化则以法氏囊与脾脏出现变性坏死等病变为主,胸腺病变略轻。
2009年03期 v.17;No.71 49-54页 [查看摘要][在线阅读][下载 302K] [阅读次数:132 ] |[下载次数:98 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:5 ] - 李玉剑;董辉;韩静芳;岳城;黄兵;韩红玉;赵其平;姜连连;郭涛;李洋;平宪卿;
为了选育堆形艾美耳球虫(Eimeria acervulina)早熟株及观测其生物学特性,运用Jeffers创立的艾美耳属球虫早熟株选育方法,对实验室保存的堆形艾美耳球虫进行连续传代早熟选育,并对获得的早熟株与母株孢子化卵囊大小、繁殖能力、致病性以及免疫保护力等指标进行了测定,比较堆形艾美耳球虫早熟株与母株之间的基本生物学特性差异。经过18代早熟选育后,堆形艾美耳球虫的潜在期由母株的99h缩短至84h。与母株相比,早熟株的孢子化卵囊大小明显减小(P<0.05),卵囊繁殖能力降低了17%~42%。致病性试验中,早熟株感染组的平均增重均高于母株,而病变记分相当。免疫保护试验中,早熟株与母株的免疫保护力相当,其卵囊抑制率略低于母株,差异不明显(P>0.05)。结果表明,本研究成功选育出堆形艾美耳球虫早熟株,对母株攻击具有保护力,为鸡球虫疫苗的研制奠定了基础。
2009年03期 v.17;No.71 55-61页 [查看摘要][在线阅读][下载 237K] [阅读次数:121 ] |[下载次数:163 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:8 ] - 王慧珍;沈祥广;刘雅红;
采用药物浓度递增法,以0.07mg/L地克珠利为起始诱导浓度连续传代,以最适抗球虫指数(POAA)、病变记分减少率(RLS)和相对卵囊产量(ROP)3项指标综合判定抗药性。经12次传代,该诱导虫株对1.5mg/L地克珠利具有完全抵抗力。试验结果表明,用实验室方法诱导柔嫩艾美耳球虫抗药株完全可行。
2009年03期 v.17;No.71 62-65页 [查看摘要][在线阅读][下载 109K] [阅读次数:98 ] |[下载次数:88 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:10 ] - 王权;陈永军;袁耀明;李安平;蒋蔚;朱志宏;安立刚;
为快速检测并准确鉴别奶牛隐孢子虫种,以隐孢子虫18S rRNA基因的特殊区域为基础,设计内、外引物,并根据软件分析确定相应的内切酶EcoT14I,采用Nested PCR-RFLP方法进行虫种种型鉴别分析。在Nested PCR两次PCR反应中,以微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum,C.p)和安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni,C.an)卵囊提取的DNA为模板,均能扩增出长约800bp和500bp的明亮条带,且特异性强,其他虫种不能扩增出条带,该方法最低可检测到5个卵囊/g粪便;对于由内引物扩增出的500bp的条带,C.an的PCR产物能被内切酶EcoT14I酶切,酶切后的片段分别为416bp和92bp,C.p的PCR产物不能被此酶酶切。用所建立的Nested PCR-RFLP法对上海奶牛389头和进口奶牛200头的共计589份粪样进行检测,Nested PCR的结果表明上海奶牛和进口奶牛的隐孢子虫阳性率分别为19.02%和3.5%,RFLP的结果表明上海奶牛感染的主要是C.p和C.an,进口奶牛感染的主要是C.p。研究结果表明,本研究建立的检测奶牛粪便中的隐孢子虫的Nested PCR-RFLP法,可用于奶牛隐孢子虫流行病学调查并有效鉴别奶牛隐孢子虫种。
2009年03期 v.17;No.71 65-72页 [查看摘要][在线阅读][下载 463K] [阅读次数:114 ] |[下载次数:149 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:4 ]