马志永
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根据伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,RV)g B基因保守序列,设计合成一套特异引物和Taq Man探针,建立了一种快速、敏感和特异的检测伪狂犬病毒的实时荧光定量PCR方法。该方法可检测到相当于10 copies/μL的病毒DNA,比常规PCR检测方法高约100倍,敏感性较强;该方法检验猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型呈现阴性结果,特异性强;变异系数小于1%,具有良好的重复性。本研究建立的实时荧光定量PCR方法为临床上对伪狂犬病毒的检测和定量奠定了坚实基础。
为制备猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)变异毒株的单抗,以纯化灭活的PRV JS-2012毒株免疫BALB/c雌性小鼠。经间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)筛选,获得2株稳定分泌PRV单抗的杂交瘤细胞:4D8、4F10。2株单抗经亚型鉴定均为Ig G1亚类,轻链为κ链,腹水IFA效价均达1:51 200;IFA与IHC结果显示,二者均能与PRV毒株发生特异性反应;Western blot结果表明,4D8与PRV反应条带大小约为60 k Da,而4F10不与PRV发生反应,推测其可能针对PRV的构象性抗原表位。该单抗的制备对PRV的抗原变异及诊断研究均有重要意义。
为研究新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)与树突状细胞特异性粘附分子-3-结合非整合素分子(dendritic cell specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin,DC-SIGN)的相互作用对NDV感染树突状细胞(dendritic cell,DC)的影响,本研究拟构建能够稳定表达DC-SIGN蛋白的细胞系,为研究DC-SIGN蛋白与病毒蛋白互作提供基础。以小鼠DCs提取的c DNA为模板,通过PCR方法获得DC-SIGN基因,连入真核表达载体,并命名为pcDNA-DCSIGN,利用LipofectamineTM 2000转染HeLa细胞,G418进行药物压力筛选,经RT-PCR和Western blot鉴定,获得了一株可以高效表达DC-SIGN蛋白的HeLa细胞,且经过多次传代后仍然可以稳定表达DC-SIGN,说明该细胞系构建成功。
本研究对安徽省某鹅场急性死亡的雏鹅进行了细菌分离鉴定,无菌采集病死鹅肝脏、脑和心包液,经过培养特性观察、染色镜检、生化特性检测以及16S rRNA和血清学检测,鉴定病原菌为血清15型鸭疫里默氏杆菌,命名为LAG1株。该分离菌株对四环素类药物敏感,而对卡那霉素等耐药;对雏鸭的致病性强,半数致死量(LD50)测定为7.75×103CFU/只;交叉免疫保护试验结果显示LAG1灭活油乳剂疫苗对自身菌株攻毒的免疫保护率可达80%以上,对血清10型鸭疫里默氏杆菌HXb2攻毒的保护率可达70%,对血清1型鸭疫里默氏杆菌WJ4和血清2型鸭疫里默氏杆菌Yb2攻毒的保护率低于20%。本研究结果可为安徽省养鹅业鸭疫里默氏杆菌病的防治工作提供参考。
为了分析鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)强毒菌株HXb2和弱毒菌株NJ-1基因组之间的差异基因,以HXb2株基因组为待测菌株,以NJ-1株基因组为驱动菌株,构建了两株细菌基因组间的抑制性差减文库。经过dot-blot杂交和PCR验证,共鉴定到34个强弱毒株基因组差异片段。测定的序列经BLAST、DNAStar和PSORTb分析,结果表明有2个片段所在基因编码的蛋白为外膜蛋白,有2个片段所在基因编码的蛋白为胞质膜蛋白如磷酸盐转运蛋白,11个片段所在基因编码的蛋白为胞内蛋白如丙氨酸脱氢酶、β-内酰胺酶及一些假定蛋白等,有19个片段所在基因编码的蛋白(大部分为假定蛋白)定位未知。这些差异基因编码的蛋白可能与鸭疫里默氏杆菌的毒力及HXb2株特异蛋白等有关。本研究为下一步鉴定新的毒力基因及其他特异蛋白的功能奠定了基础。
日本血吸虫混合与单性感染雌虫在形态上存在明显的差异,为了更进一步观察二者生殖器官的差异,本研究采用激光共聚焦观察感染雌虫卵巢和卵黄腺,透射电镜观察卵黄腺,并用原位末端转移酶标记法观察卵黄腺的凋亡水平。激光共聚焦结果表明,混合感染雌虫卵巢和卵黄腺可见成熟的细胞而单性感染雌虫仅存在未成熟的细胞;透射电镜结果表明两者卵黄腺细胞的细胞核和核仁在大小及形态方面有很大差异,混合感染雌虫可见明显的卵黄滴,单性感染雌虫无卵黄滴但有聚集和散在分布的脂滴;原位末端转移酶标记法结果表明,两者皆未呈现明显的凋亡现象。可见,混合与单性感染雌虫不仅在虫体大小和器官形态上,细胞形态和亚细胞结构也存在差异。
应用重氮化方法制备了磺胺氯吡嗪钠(sulfachloropyrazine sodium,SPZ)完全抗原SPZ-OVA,将成功偶联的人工全抗原(SPZ-OVA)免疫BALB/c小鼠,免疫4次后,经间接ELISA检测,1号小鼠血清抗体效价达到1:6.4×104。取该小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。利用ELISA方法对融合后的杂交瘤细胞上清进行检测,筛选出能够稳定分泌抗体的细胞株:D9。将细胞株D9扩大培养后,经腹腔注射小鼠使其产生腹水。腹水单抗经纯化后,通过间接竞争ELISA对该单克隆抗体的效价、半数抑制浓度以及特异性进行检测。结果表明,所制备的单克隆抗体效价为1:4×105,半数抑制浓度为326 ng/m L,特异性良好。
根据鸭Toll样受体3(Toll-like receptor 3,TLR3)的基因序列保守区设计特异性引物,以鸭β肌动蛋白(β-actin)mRNA为内参,建立了一种检测鸭TLR3 mRNA表达水平的实时荧光定量PCR方法。该方法的标准曲线在1×102~1×108copies/μL范围内,具有良好的线性关系,相关系数和扩增效率均在0.9以上。熔解曲线显示,PCR产物为单峰,具有高度扩增特异性。重复性结果表明,该方法组内、组间变异系数均小于3%,最低检测浓度达100 copies/μL。利用该方法检测了TLR3在鸭组织器官中的表达和分布情况,结果表明,TLR3在鸭子的各种组织或器官中均有分布,其中以气管的表达水平最高,而在脾脏的表达水平最低。该检测方法的成功建立为研究TLR3在鸭天然免疫过程中的生物学功能提供了良好的技术手段。
根据鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)的3D基因序列和新型鸭呼肠孤病毒(Novel Duck reovirus,NDRV)的S3基因序列,分别设计了1对特异性引物,通过条件优化建立了鉴别DHAV和NDRV的复合RT-PCR方法。该方法对DHAV和NDRV的最低检出量均为100 copies,而对番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)、鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)、鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)和鸭副粘病毒(Duck paramyxo virus,NDV)的检测结果均为阴性。临床样品的检测结果显示,该方法是一种快速鉴别诊断DHAV和NDRV感染的有效手段。
为了解上海市屠宰场上市肉猪主要病毒的感染情况,2011~2014年在上海市5个屠宰场共采集759份血清样品,采用ELISA方法进行了口蹄疫、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征抗体检测;采用荧光PCR方法对720份组织样品进行了口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪流感病毒、猪细小病毒7种病毒检测。血清学检测结果显示,猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、口蹄疫抗体平均阳性率依次为96.6%、72.3%、66.4%。荧光PCR检测结果:口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病毒均为阴性,但猪圆环病毒2型、猪细小病毒阳性率较高,阳性率分别是37.9%、8.3%。由此可见,上海市屠宰场上市肉猪重大动物疫病防控已有一定效果,但猪圆环病毒2型和猪细小病毒仍具有较高阳性率,对猪群健康存在一定的危害。
为探索川藏黑猪和长白猪的猪瘟免疫方法,本研究采用猪瘟阻断ELISA对0、1、4、7、10、20、25、30、35日龄时川藏黑猪与长白猪仔猪的猪瘟母源抗体水平进行了检测。结果显示,川藏黑猪仔猪和长白猪仔猪出生后哺母乳前的猪瘟母源抗体均为0,哺母乳后d1,猪瘟母源抗体分别为>210和28.2,合格率分别为100%和87%。4日龄和7日龄时,川藏黑猪仔猪的猪瘟母源抗体仍为≥210,合格率100%;长白猪仔猪的猪瘟母源抗体为28.4和27.4,合格率100%和83%;随后川藏黑猪仔猪的猪瘟母源抗体呈下降趋势,35日龄达到保护临界值(24.0);长白猪仔猪的猪瘟母源抗体下降更迅速,25日龄时其母源抗体水平已达临界值(24.0)。检测结果表明无论是母源抗体水平还是母源抗体持续时间,川藏黑猪与长白猪仔猪之间有较大差异,川藏黑猪仔猪猪瘟疫苗的首免时间应为35日龄,而长白猪仔猪猪瘟疫苗的首免时间应为25日龄。
为了解新疆维吾尔自治区南疆部分地方驴泰勒虫和驽巴贝斯虫病的存在情况,本文采用PCR技术和竞争性酶联免疫吸附试验(c-ELISA)检测喀什部分地区驴泰勒虫病和驽巴贝斯虫病的流行情况。调查结果显示,喀什地区疏勒县和疏附县驴寄生虫总感染率为45.17%。通过PCR方法检测出19份血样感染泰勒虫病,感染率为36.84%;未检出驽巴贝斯虫病。通过c-ELISA方法检测出96份血清感染泰勒虫病,感染率为7.29%;驽巴贝斯虫的感染率为1.04%。通过本次驴寄生虫感染调查,对喀什部分地区驴寄生虫感染情况有了初步了解,为该地区驴的健康发展提供了科学依据。
为了解新疆维吾尔自治区阿勒泰地区富蕴县马匹在舍饲和放牧2种饲养条件下感染的消化道线虫情况,随机采集样品74份,采用常规寄生虫病原学检查方法进行调查。调查结果显示,当地马总感染率为94.59%,主要感染的虫种为马圆线虫、毛线虫、细颈三齿线虫、马副蛔虫,感染率分别为83.78%、83.78%、24.32%、4.05%。本次调查数据可为当地马寄生虫病的计划性驱虫保健提供科学依据。
寄生虫是包括原虫、吸虫、绦虫、线虫、棘头虫等在内的一大类生物的总称,可引起重要的人畜寄生虫病。抗寄生虫药物的长期使用甚至是滥用使得寄生虫对现有药物产生了明显的抗药性,急需开发新型药物以有效控制寄生虫感染。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)是糖酵解途径的末端酶,在还原型辅酶Ⅰ(NADH)和氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)的辅助下,催化丙酮酸与乳酸之间的可逆反应,释放能量供寄生虫所需。本文针对抗寄生虫药物靶标的鉴定方法以及寄生虫LDH作为潜在药物靶标的研究进展进行了综述,对阐明药物的分子作用机理及研发新药具有重要的理论意义。
传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)是引起急性、高度接触性鸡传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)的病原体。该病毒感染引起的高传染性和免疫抑制给养禽业带来巨大的经济损失,3周龄以下鸡群感染是导致免疫抑制和免疫缺陷时诱发二次感染和对其他病原免疫失败的重要原因。IBDV的研究得到越来越多的重视,对IBDV编码蛋白功能的认识有助于深入了解IBDV的致病机制,也为IBD的防控提供了重要依据。
<正>《中国动物传染病学报》杂志由中华人民共和国农业部主管,中国农业科学院上海兽医研究所主办。本刊坚持普及与提高,理论与实践相结合,重在促进动物传染病学的基础理论研究,促进国内外学术交流,提高我国动物传染病防控、诊断与治疗水平。