- 钱琨;顾丙泉;王明珍;金文杰;秦爱建;
本研究参考GenBank已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Nsp2基因序列,在高致病性病毒Nsp2基因缺失区的两端保守区设计并合成了一对引物,建立并优化了能够区分经典PRRSV和高致病性PRRSV的RT-PCR诊断方法,并利用该方法对2007~2010年间江苏地区的45份可疑临床病料进行了检测。结果表明临床病料阳性率为40%,所有毒株均属于高致病性毒株。对PRRSV阳性病毒的Nsp2基因序列分析表明,所有18株PRRSV均属于美洲型毒株,与中国高致病性PRRSV代表毒株JXA1、WUH1的氨基酸同源性分别在82.2%~97.6%、80.4%~95.3%。此外,18株病毒的Nsp2共同存在不连续的30个氨基酸缺失,缺失位置与同期中国高致病性PRRSV具有相同的特征。通过本研究掌握了江苏地区2007~2010年间PRRSV流行情况及Nsp2基因变异特征,为地方猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断和防治提供参考依据。
2011年04期 v.19;No.82 1-6页 [查看摘要][在线阅读][下载 1559K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：89 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] - 杨吉飞;关贵全;刘志杰;汪月凤;李有全;马米玲;刘爱红;任巧云;苟惠天;杜鹏飞;罗建勋;殷宏;
本研究基于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)vp72基因设计引物,建立了能够快速检测非洲猪瘟病毒的环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。将LAMP与OIE参考的PCR检测方法进行比较,并且应用LAMP对非洲猪瘟参考实验室提供的非洲猪瘟病毒17个毒株的基因组以及国内收集的50份猪的基因组、30份蜱的基因组进行检测。结果显示,本研究设计的引物具有良好的特异性和敏感性,所建立的LAMP能够成功扩增非洲猪瘟病毒17个毒株的基因组,而野外收集的猪和蜱的基因组检测均为阴性。因此,本研究所建立的方法能够用于非洲猪瘟的快速诊断以及防控。
2011年04期 v.19;No.82 7-12页 [查看摘要][在线阅读][下载 744K] [阅读次数：1 ] |[下载次数：568 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：29 ] - 杨馥如;于海;王斌;黄梦;马继红;周艳君;童光志;
DNA疫苗的免疫效果与抗原基因的表达量及表达抗原的免疫原性有直接关系。为了提高猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)HA基因DNA疫苗的表达量,增强其免疫效果,本研究通过人工合成的方法将H1亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)的HA基因密码子优化为猪体内偏嗜性密码子optiHA,同野生型A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)的HA基因分别与真核表达载体PCAGGS连接构成重组质粒PCAGGS-optiHA和PCAGGS-HA,然后分别转染293T细胞,48 h后采用间接免疫荧光的方法检测HA基因的瞬时表达蛋白情况。将质粒PCAGGS-HA、PCAGGS-optiHA以100μg/只的剂量,采用后腿肌肉多点注射的方式,免疫6~8周龄雌性BALB/c小鼠,同时设立空载体PCAGGS对照。共免疫3次,每次间隔2周,三免2周后对每组以103.87 EID50的A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)进行攻毒。采用ELISA、血凝抑制试验、细胞因子检测和肺组织病毒含量测定等实验评价这两种DNA疫苗的免疫效果。结果表明,HA基因密码子优化的DNA疫苗可显著提高体液免疫和细胞免疫的应答水平,攻毒后免疫组PCAGGS-optiHA的保护效力明显高于免疫组PCAGGS-HA。这一结果为进一步研究和设计有效的SIV DNA疫苗奠定了基础。
2011年04期 v.19;No.82 13-19页 [查看摘要][在线阅读][下载 719K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：189 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] - 万春和;朱海侠;黄瑜;彭春香;程龙飞;施少华;傅光华;陈红梅;
根据GenBank登录的鹅细小病毒基因序列和基因组结构特征,采用PCR技术扩增获得一株鹅细小病毒株(Goose parvovirus,GoPV)全基因序列,为中国大陆地区首次报道。GoPV株病毒全基因大小为5106 nt,其基因组5'端和3'端均含有相同的末端倒置重复序列(inverted terminal repeats,ITR),ITR全长为444 nt。GoPV基因组主要由左右两侧两个开放阅读框组成,左侧编码非结构蛋白(non-structure protein,NS)NS1和NS2,右侧编码3种结构蛋白(viral structural protein,VP)VP1、VP2和VP3。NS基因全长为1884 nt(537~2420 nt),其中NS2全长1356 nt(1065~2420 nt);VP基因全长2199nt(2439~4637 nt),其中VP2全长1764 nt(2874~4637 nt),VP3全长1605 nt(3033~4637nt),在其右侧的ITR前有一个Poly(A)的尾。GoPV株病毒全基因和欧洲疫苗株(EU583392(VG32/1,Europe))核苷酸同源性最高,高达98.6%。本研究为进一步研究GPV分类地位以及进化关系提供依据,也为研究GPV强毒株和疫苗株之间生物学特性以及GPV治病机理和开发基因工程疫苗奠定基础。
2011年04期 v.19;No.82 19-24页 [查看摘要][在线阅读][下载 522K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：298 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：29 ] - 阿荣;武燕斌;刘志伟;李培锋;杨志彪;崔立;梁爱斌;华修国;
以TTMV重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了检测人TTMV血清抗体的间接ELISA方法,结果显示:抗原最佳包被浓度为1.63μg/mL,37℃孵育1 h后4℃过夜;血清稀释度为1:320;酶标二抗孵育时间为37℃60 min;ELISA酶标板的临界值为0.211。运用该方法对上海市和辽宁省共计280份血清样品进行检测,阳性检出率分别为34.68%和39.74%。检测结果表明,建立的间接ELISA方法特异性与重复性均较好,为进一步完善TTMV临床诊断方法打下了基础。
2011年04期 v.19;No.82 25-30页 [查看摘要][在线阅读][下载 397K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：66 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ]
- 张艳丽;贾侃;李莹;苑纯秀;杨健美;林矫矫;冯新港;
为分离鉴定日本血吸虫含EF手性结构域分子及分析其序列结构特征,首先找到含有EF-hand结构域的分子,按照序列一级结构进行分类,之后进行生物信息学分析。然后用PCR方法以虫卵和成虫cDNA文库为模板扩增分类后的分子,构建重组质粒,诱导蛋白表达并纯化,选取14个纯化蛋白用Western blot进行初步免疫原性鉴定。结果269个原始含EF-hand结构域分子按照序列一级结构分为70个;成功表达和纯化了49个含EF手性分子,进化树分析将其分为9类;Western blot显示,14个纯化蛋白均可被日本血吸虫感染小鼠阳性血清识别。本研究结果为下一步采用这类分子进行动物保护性效果评价以及保护性免疫机制的研究奠定了基础。
2011年04期 v.19;No.82 35-47页 [查看摘要][在线阅读][下载 1058K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：113 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] - 李东;朱珠;石耀军;陆柯;彭金彪;洪炀;张旻;韩彦辉;
应用大肠杆菌表达日本血吸虫抱雌沟蛋白(Schistosoma japonicum gynecophoral canal protein,SjGCP),将重组蛋白rSjGCP与FCA、ISA 206、ISA70M三种佐剂混合后免疫BALB/c小鼠,分析重组抗原诱导的免疫保护机制。用流式细胞术检测三次免疫后小鼠体内CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群和IL-2、IL-4、γ-IFN、IL-10等细胞因子,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗SjGCP特异性lgG抗体及其亚型lgG1水平。和空白对照组相比,GCP-FCA组和GCP-206组小鼠脾细胞中CD8+T淋巴细胞比例显著下降,而GCP-70M组的CD4+T淋巴细胞显著下降;GCP-FCA组、GCP-206组中IL-4、IL-10表达水平均显著上升;GCP-FCA组、GCP-206组、GCP-70M组血清中特异性IgG1亚型抗体含量显著升高。本研究为探讨重组日本血吸虫抱雌沟蛋白诱导的免疫保护机制积累了有价值的数据。
2011年04期 v.19;No.82 48-54页 [查看摘要][在线阅读][下载 426K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：69 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] - 蔡兰;韩红玉;黄兵;董辉;赵其平;姜连连;
为了确定鸡艾美耳球虫(Eimeria)不同种以及来自不同地区同种不同株之间的亲缘关系,研究其分类地位,对实验室保藏的柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、堆形艾美耳球虫(E.acervulina)等4种15株鸡球虫孢子化卵囊的18S rDNA基因进行克隆、测序,并与从GenBank下载的鸡球虫18S rDNA序列一起,使用软件DNAstar 5.0 MegAlign进行系统发育分析。结果显示,4种艾美耳球虫种间同源性在94.6%~99.4%之间,7株柔嫩艾美耳球虫的株间同源性在99.0%~99.9%之间,5株巨型艾美耳球虫的株间同源性在96.9%~99.8%之间。用该4种鸡球虫的18S rDNA序列与GenBank下载的另外4种鸡球虫18S rDNA序列构建系统发育树,显示这8种鸡艾美耳球虫形成2个分支,即堆形艾美耳球虫(EASH)、巨型艾美耳球虫(EMSH)、变位艾美耳球虫(E.mivati)、和缓艾美耳球虫(E.mitis)、布氏艾美耳球虫(E.brunetti)、早熟艾美耳球虫(E.praecox)构成1个分支,柔嫩艾美耳球虫(ENSH)、毒害艾美耳球虫(ETAS)构成另1分支。巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫各株的系统发育树均根据地域关系产生2个分支。柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫的亲缘关系较近,不同地理区域的同种不同株的亲缘关系相对较远,种间和种内的鉴定结果与普通生物学结果一致。本研究提示18S rDNA基因可用于鸡球虫不同种/株的分类鉴定,为艾美耳球虫分子遗传学鉴定提供了理论基础。
2011年04期 v.19;No.82 55-61页 [查看摘要][在线阅读][下载 565K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：256 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] - 周春景;罗荣;石耀军;丁硕;杨德浩;程国锋;
本研究利用生物信息学分析日本血吸虫编码Akt蛋白的cDNA并对编码该蛋白的cDNA进行了克隆和原核表达。生物信息学分析表明日本血吸虫存在两个Akt蛋白。利用PCR将其中一个Akt蛋白催化功能域的编码cDNA进行了克隆,并利用原核表达系统对此蛋白片段进行诱导表达并进行了重组蛋白的纯化,将重组蛋白免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体。Western blot分析表明,该抗体能被日本血吸虫Akt重组蛋白特异性识别。本研究为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。
2011年04期 v.19;No.82 62-67页 [查看摘要][在线阅读][下载 481K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：77 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] - 米晓云;古努尔·吐尔逊;张壮志;石保新;金映红;张旭;赵莉;张文宝;
按照多房棘球绦虫幼虫-泡球蚴培养的培养基(RPMI-1640、M199和MEM)分为3组:Ⅰ组为含10%胎牛血清的RPMI-1640;Ⅱ组为含10%胎牛血清的MEM;Ⅲ组为含10%胎牛血清的M199。将泡球蚴在3种细胞培养液中进行培养,观察其存活、生长以及发育情况。结果显示,培养9 d的泡球蚴的成活率分别为:Ⅰ组90.10%、Ⅱ组50.25%、Ⅲ组22.03%;成囊率分别为:Ⅰ组57.12%、Ⅱ组63.15%、Ⅲ组48.17%;头节外翻率分别为:Ⅰ组98.28%、Ⅱ组88.65%、Ⅲ组75.50%。可见,大多数虫体在早期向囊发育,一部分虫体头节外翻,并伴有规律的伸缩运动,但随时间的延长虫体运动减缓,又向囊蚴发育。通过对多房棘球绦虫泡球蚴的体外培养,初步表明含有10%小牛血清的细胞培养基RPMI-1640较适合泡球蚴的生长发育,为研究寄生虫发育提供了最基本的数据资料。
2011年04期 v.19;No.82 67-70页 [查看摘要][在线阅读][下载 342K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：243 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：13 ]