- 王晓丽;毕振威;王永山;潘群兴;欧阳伟;夏兴霞;诸玉梅;
将分离的H3N2亚型犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)A/Canine/Nanjing/11/2012(H3N2)株的核蛋白(NP)基因克隆至原核表达载体p ET28a(+)中,构建重组表达质粒p ET-NP,然后转化大肠杆菌E.coli Rosetta(DE)感受态细胞,经IPTG诱导后,采用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果显示,大肠杆菌表达的重组NP蛋白的分子量约为61 k Da,与预期相符,并能与犬CIV阳性血清发生特异性反应。将表达的重组NP蛋白进行纯化后,免疫大白兔制备抗NP蛋白多克隆抗体血清,Western blot检测该血清可与CIV的NP蛋白发生特异性反应,间接ELISA检测该多克隆抗体血清的效价达1:30 000,显示了较高的抗体效价。本研究为CIV快速检测方法的建立和流行病学调查奠定了科学依据。
2017年01期 v.25;No.115 1-6页 [查看摘要][在线阅读][下载 1042K] [阅读次数：1 ] |[下载次数：275 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] - 谭永贵;刘腾;朱杰;郭慧敏;吴巧梅;李琦;缪秋红;陈宗艳;李传峰;刘光清;
本研究建立了一种荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR)结合熔解曲线区分不同亚型兔病毒性出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)方法。根据GenBank数据库中已公布的不同亚型RHDV(经典RHDV和RHDV2)的衣壳蛋白VP60序列保守区设计了1对特异性引物,利用SYBR Green II荧光染料,在实时荧光定量PCR方法的基础上结合熔解曲线进行分析,经典RHDV和RHDV2熔解温度(Tm)分别为(86.3±0.1)℃和(85.1±0.1)℃,扩增产物的熔解曲线分析均只出现单特异峰。结果表明,本研究建立的方法能够快速地鉴别经典RHDV和RHDV2。
2017年01期 v.25;No.115 7-11页 [查看摘要][在线阅读][下载 997K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：218 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] - 董嘉文;李林林;孙敏华;张建峰;邝瑞欢;胡奇林;张春红;
本研究利用RT-PCR扩增鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)JM株E基因截断片段(822 bp),并将其克隆至原核表达载体p ET32a(+),成功构建了重组质粒p ET32a-E。重组质粒转化大肠杆菌Rosseta,经IPTG诱导得到了高效表达。Western blot分析表明,重组蛋白能与DTMUV阳性血清发生特异性反应。将纯化好的DTMUV E蛋白作为包被抗原,建立了检测DTMUV血清抗体的间接ELISA方法。经过条件优化,确定了抗原最适包被浓度为0.093μg/孔,血清的最佳稀释度为1∶100。批内和批间重复试验的最大变异系数分别为3.53%和9.73%。用建立的ELISA方法对免疫鸭坦布苏病毒灭活疫苗的鸭血清和对照鸭血清进行抗体检测,同时与攻毒保护试验进行比较,两者的阳性符合率为86.67%,阴性符合率为100%。
2017年01期 v.25;No.115 12-18页 [查看摘要][在线阅读][下载 1314K] [阅读次数：1 ] |[下载次数：255 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：17 ] - 侯月娥;伍建敏;李中圣;
本文通过对猪腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)基因组生物信息学分析,分别在两种病毒基因保守区设计特异性探针和Real-Time PCR引物,并建立了检测PEDV和TGEV的双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果表明,本研究建立的方法对其他常见病毒无交叉检出,具有较强的特异性;应用本方法对PEDV和TGEV检测灵敏度均可达101个拷贝。应用本法组装PEDV和TGEV双重实时荧光定量PCR试剂盒,该试剂盒批次内、批次间的变异系数CV(coefficient of variation,CV)分别低于0.58%和3.7%。应用该试剂盒对97份病例进行检测,阳性率提高了14.93%。本研究建立的一步法荧光定量RT-PCR方法具有快速、特异性好、灵敏度高、定量且重复性和稳定性好等优点,在PEDV和TGEV感染的快速鉴别诊断,以及流行病学调查方面都有广阔的应用前景。
2017年01期 v.25;No.115 19-25页 [查看摘要][在线阅读][下载 1566K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：313 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：19 ] - 童武;李国新;郑浩;刘飞;梁超;田青;李林;曹艳云;武吉强;王涛;郑旭晨;单同领;童光志;
为了确定猪伪狂犬病基因缺失灭活疫苗(PRV JS-2012-△g I/g E株)的最小免疫剂量,本研究将25头14日龄仔猪(猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型病原抗体均为阴性)随机分成5组,每组5头。第1~4组分别接种猪伪狂犬病灭活疫苗(PRV JS-2012-△g I/g E株)0.5、1、2、3 m L/头,免疫28 d后各组参照第1次免疫的剂量分别加强免疫1次,第5组实验猪不做处理作为阴性对照。免疫后,每周采集各组猪血清检测抗体水平。待第2次免疫28 d后,5组实验猪均滴鼻接种PRV JS-2012株第5代强毒2 m L,含病毒105.0TCID50/头。结果表明:第1次免疫后14 d,第2~4组猪PRV g B抗体全部转为阳性,而第1组猪在第1次免疫后21 d全部转阳。攻毒后,第1组有1头猪发病,表现精神沉郁、厌食和轻微神经症状,其余4头猪有一过性的发热,无任何其他异常临床表现,保护率为80%;第2~4组,实验猪只有一过性的发热,无任何其他异常临床表现,保护率为100%;第5组猪在攻毒后48 h,体温迅速上升到41℃以上,并表现为明显的精神沉郁、厌食和神经症状,发病率为100%,死亡率为40%。由此确定猪伪狂犬病灭活疫苗(JS-2012-△g I/g E株)最小免疫剂量为1 m L/头。
2017年01期 v.25;No.115 26-31页 [查看摘要][在线阅读][下载 2259K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：314 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] - 葛杰;葛菲菲;刘健;杨德全;李鑫;鞠厚斌;周锦萍;
为了解上海市活禽批发市场中家禽停留时间与H9亚型禽流感病毒检出之间的关系,连续4 d每隔24 h在2个批发市场各4个固定摊位共采集960份活禽咽喉/泄殖腔拭子样品。采用H9亚型荧光RT-PCR方法对样品进行检测,结果发现随着时间的推移,H9亚型禽流感病毒在同一个摊位和不同摊位间传播扩散,并且随着家禽在批发市场内停留时间的延续,H9亚型禽流感病毒的阳性检出率明显上升,72 h时最高达到24.58%,提示我们应加强活禽批发市场禽流感的监测和监管。
2017年01期 v.25;No.115 32-35页 [查看摘要][在线阅读][下载 912K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：67 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ]
- 陈宁;王平;程田;龚振兴;谢天柱;李俊鹏;张延忠;王晓炜;鲁艺;
为获得鼠隐藏管状线虫(Syphacia obvelata)烯醇化酶结构及其功能,采用同源克隆方法结合RACE技术克隆获得了烯醇化酶基因c DNA序列,并对其进行了序列分析。测序结果显示,扩增获得的鼠隐藏管状线虫烯醇化酶基因大小序列为1603 bp,包含全长为1311 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,共编码436个氨基酸,推导分子量为47.428 k Da。序列分析结果显示,鼠隐藏管状线虫烯醇化酶含有10个丝氨酸激酶磷酸化位点、3个苏氨酸激酶磷酸化位点和4个酪氨酸激酶磷酸化位点,1个潜在的跨膜螺旋结构,无信号肽剪切位点;在亚细胞水平,预测其主要定位于胞浆;二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,其中α-螺旋占34.86%,无规则卷曲占30.50%,延伸链占24.08%,β-转角占10.55%。Swiss-Model模建的3D结构显示,鼠隐藏管状线虫烯醇化酶为一"哑铃"样结构,包含氨基端和羧基端两个结构域,结构域之间为Linker区。每个结构域由多个α-螺旋、β-折叠和卷曲所构成桶形结构,催化中心和Mg~(2+)结合位点位于桶形结构的中心。本研究结果为鼠隐藏管状线虫烯醇化酶基因的功能研究奠定基础。
2017年01期 v.25;No.115 50-58页 [查看摘要][在线阅读][下载 2338K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：67 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] - 李丹丹;马丽贞;苑纯秀;史晓娜;艾敏;塔娜;冯新港;
为研究日本血吸虫高迁移率族蛋白(Schistosoma japonicum high mobility group box1,Sj HMGB1)体外活化小鼠巨噬细胞的功能,利用真核重组Sj HMGB1蛋白与巨噬细胞共培养48 h,流式细胞术检测巨噬细胞表面标志分子以及趋化因子受体的表达。收集Sj HMGB1蛋白与巨噬细胞共孵育48 h后上清,ELISA检测上清中TNF-α与IL-10的含量,Griess法检测上清中NO的含量。流式结果显示,与对照组相比,Sj HMGB1蛋白刺激组的巨噬细胞表面MHC-Ⅱ分子,TLR4受体以及趋化因子受体CCR7的表达显著上调且差异具有极显著统计学意义(P<0.01),TLR2受体的表达显著下调,差异具有显著统计学意义(P<0.05)。ELISA结果显示,Sj HMGB1能够刺激巨噬细胞分泌致炎因子TNF-α,未能促进抑炎因子IL-10的释放。Griess法表明Sj HMGB1能够促进巨噬细胞分泌NO。本研究结果表明Sj HMGB1可能通过TLR4通路活化小鼠巨噬细胞并诱导其向致炎性M1型巨噬细胞极化。
2017年01期 v.25;No.115 59-65页 [查看摘要][在线阅读][下载 1168K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：80 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] - 宰金丽;马帅;王涛;贾秉光;柴淑梅;张倩;林矫矫;傅志强;
本研究扩增到日本血吸虫Sj TOR完整的蛋白编码区并将其克隆到p XJ40-FLAG载体的HindⅢ、XhoⅠ酶切位点,构建真核表达质粒p XJ40-FLAG-TOR。将测序正确的质粒转染到293T细胞中进行表达,然后应用间接免疫荧光、实时荧光定量PCR、Western blot检测其在293T细胞中的表达情况。测序结果表明Sj TOR蛋白编码区为1245 bp,真核表达质粒p XJ40-FLAG-TOR构建成功。转染293T细胞48 h后,应用间接免疫荧光染色可观察到转染重组质粒的细胞有特异性绿色荧光,空质粒对照则未见。实时荧光定量PCR结果显示,在转染质粒p XJ40-FLAG-TOR 6 h后Sj TOR蛋白的基因已有转录,至转染24 h时转录水平最高,随后开始降低。Western blot结果显示Sj TOR蛋白分子量约53 k Da,可被FLAG单抗和抗Sj TOR-ED1抗血清识别。结果表明Sj TOR蛋白可以在293 T细胞中表达,为进一步研究Sj TOR蛋白的生物学功能和DNA疫苗打下了基础。
2017年01期 v.25;No.115 66-71页 [查看摘要][在线阅读][下载 1305K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：102 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] - 彭欠欠;苏佳文;崔子鹤;石火英;
本研究通过疾病的调查、肉眼病变和组织病理学观察的方法,对扬州大学动物医院收集送检病鸡进行了病理学诊断。病鸡临床症状表现为精神萎靡,鸡冠发紫,排出淡绿色稀粪;剖检病鸡可观察到肝脏肿大,表明有大小不等的黄褐色坏死灶,盲肠肿大,内有黄色干酪样栓子;显微镜下肝脏和盲肠中有嗜伊红的组织滴虫虫体,并有大量嗜酸性粒细胞存在。经临床症状观察、病理剖检以及病理组织学诊断,确诊为鸡组织滴虫病。
2017年01期 v.25;No.115 72-74页 [查看摘要][在线阅读][下载 2008K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：148 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：9 ]