- 刘柱;李丹丹;李琦;宫晓华;缪秋红;李传峰;陈宗艳;张淼涛;刘光清;
本研究对犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)安徽分离株(CDV-AH株)的全基因组序列进行了测定和分析。根据GenBank上已发表的部分CDV基因组全长序列设计了8对特异性引物,RT-PCR方法分段扩增出CDV-AH株的全基因组序列。采用DNAStar软件和MEGA软件对CDV-AH株与其他CDV毒株的基因序列进行了比对和分析,并绘制系统进化树。结果显示,CDV-AH株全长15 690 bp,编码6种结构蛋白(N、P、M、F、H和L),与CDV-PS株核苷酸序列同源性最高,为98.8%,而与CDV-1以及Onderstepoort等疫苗株的序列同源性较低,为92.1%。CDV-AH株在保守区域出现15处氨基酸突变,这些突变对其所编码蛋白结构和功能的影响需要进一步研究。基于H基因序列的系统进化分析表明,CDV-AH株与其他CDV野毒株共同形成一个拓扑群,属于亚洲Ⅰ型。
2017年02期 v.25;No.116 1-8页 [查看摘要][在线阅读][下载 888K] [阅读次数：1 ] |[下载次数：141 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] - 焦美会;刘家森;姜骞;陆涛峰;胡小亮;蒋艳妹;曲连东;
为筛选出兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)衣壳蛋白VP60特异性核酸适配体,建立新型的兔出血症(rabbit hemorrhagic disease,RHD)检测方法,本研究构建了一个长80 nt的随机寡核苷酸文库。以固定在PVDF膜上的VP60为靶分子,使用消减SELEX技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)进行20轮的筛选,以生物素标记的次级文库作为"一抗",以辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素作为"二抗",对文库进行Western blot鉴定,结果表明第20轮文库存在可特异性的识别VP60的核酸序列。随机选取第20轮文库的46条序列克隆、测序,得到20个高度同源序列,同时对46个适配体再次鉴定,最终得到3个特异性识别VP60的适配体。
2017年02期 v.25;No.116 9-13页 [查看摘要][在线阅读][下载 842K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：146 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] - 汪伟;张耀丹;任亭亭;孟春春;谭磊;孙英杰;宋翠萍;廖瑛;仇旭升;丁铲;罗廷荣;
锌指蛋白ZEB1(zinc finger E-box binding homeobox 1)是一种在不同物种中相对保守的转录因子,尤其在发生肿瘤的组织中具有较高的表达水平。为了证实禽类锌指蛋白ZEB1在新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染中的作用,本研究扩增获得了鸡源ZEB1的基因序列,并通过生物信息学软件对不同物种的ZEB1基因进行了同源性比对。通过Real-time PCR技术测定NDV感染DF-1细胞、CEF细胞以及SPF鸡后ZEB1的表达量变化,证实NDV感染可使细胞中的ZEB1含量显著升高。但是在细胞中过表达ZEB1对NDV的增殖和蛋白表达没有明显的影响,其生物学意义有待进一步研究。
2017年02期 v.25;No.116 14-21页 [查看摘要][在线阅读][下载 1208K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：106 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] - 王涛;童武;叶超;于之清;梁超;李国新;高飞;单同领;于海;郑浩;童光志;
近年来我国出现伪狂犬病毒变异株,导致猪伪狂犬病重新爆发流行。为研究伪狂犬病毒变异株毒力增强与抗原变异的分子机制,需要建立该病毒的感染性克隆操作系统。本研究通过构建转移载体pTEGGF,利用同源重组将含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)表达框及两翼各一个loxp位点,插入到伪狂犬病毒变异株PRV JS-2012 gG编码区下游,获得重组病毒rJS2012-gG/EGFP。将表达Cre重组酶的质粒pcDNA3.1-Cre转染BHK-21细胞,再感染rJS2012-gG/EGFP,筛选获得含有单一loxp位点的重组病毒rJS2012-gG/loxp。将rJS2012-gG/loxp基因组、含有EGFP标记基因的BAC载体p Belo BAC11-EGFP和pcDNA3.1-cre共转染BHK-21,获得含有BAC序列插入的重组病毒rJS2012-BAC。一步生长曲线与空斑试验显示,重组病毒rJS2012-BAC在体外生长略慢于亲本病毒。本研究成功构建了含有BAC载体的重组伪狂犬病毒,为进一步建立伪狂犬病毒变异株的感染性克隆操作系统,开展变异株的分子病原学研究打下良好基础。
2017年02期 v.25;No.116 22-28页 [查看摘要][在线阅读][下载 1280K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：442 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] - 刘晓敏;汪琪;杨海明;宫晓倩;阮宝阳;张鹏;单同领;童武;童光志;于海;
利用RT-PCR技术扩增了禽源H9N2亚型猪流感病毒A/Swine/Guangxi/7/2007(H9N2)的8个目的基因片段,分别克隆至pBD双向转录表达载体。将8个重组质粒纯化后共转染293T细胞,54 h后收集上清,接种MDCK细胞。当拯救的病毒在MDCK细胞上增殖至第3代时,收集的细胞上清经检测具有血凝效价。经过测序分析,确定获救病毒的8个基因片段序列与野生株完全一致,表明病毒拯救成功。禽源H9N2亚型猪流感病毒反向遗传操作技术平台的成功建立为探索猪流感病毒致病机理、传播机制与基因功能研究奠定了基础。
2017年02期 v.25;No.116 29-34页 [查看摘要][在线阅读][下载 837K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：232 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] - 张耀丹;汪伟;李继红;刘开春;孟春春;孙英杰;谭磊;宋翠萍;廖瑛;仇旭升;丁铲;
目前对家禽中双链RNA特异性腺苷脱氨酶(adenosine deaminase acting on double-stranded RNA,ADAR)的种类、组织分布及其功能尚不明了。本研究中以刀豆素、poly I:C以及新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)作为刺激物诱导鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast,CEF)中ADARs基因上调,扩增获得鸡ADAR2基因的mRNA。为了鉴定ADAR2的抗病毒作用,本研究构建了能够偶联有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的ADAR2重组真核表达质粒,转染DF1细胞,结果显示在过量表达ADAR2的细胞中,NDV的增殖受到了显著抑制,表明ADAR2在NDV感染过程中发挥重要的抗病毒作用,这为进一步研究鸡RNA编辑酶对NDV RNA编辑奠定了基础。
2017年02期 v.25;No.116 35-42页 [查看摘要][在线阅读][下载 1143K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：106 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] - 夏天奇;姜一峰;虞凌雪;周艳君;杨莘;高飞;李丽薇;曲泽慧;童光志;
猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染后能够引发机体产生免疫抑制,IL-10在病毒介导的免疫抑制中起重要作用。PRRSV HuN4株感染PAM细胞后能够诱导IL-10高水平表达,而其传代致弱毒株HuN4-F112感染PAM细胞后IL-10表达水平很低。本研究以PRRSV HuN4株及HuN4-F112株为研究对象,对其感染PAM细胞后IL-10上游关键因子表达差异进行研究,揭示诱导IL-10产生差异的分子基础。结果显示,PRRSV强弱毒感染PAM细胞后,强毒HuN4株诱导TLR2与TLR4转录水平显著高于弱毒HuN4-F112株,TLR3、TLR7和TLR9转录水平则无显著差异;强毒HuN4株感染PAM细胞后,其p38磷酸化水平显著高于弱毒HuN4-F112株,而ERK磷酸化水平差异不具备显著统计学意义。结果提示,PRRSV强弱毒株感染PAM细胞诱导IL-10表达水平的差异推测是由于强弱毒诱导p38 MAPK磷酸化水平差异造成的。
2017年02期 v.25;No.116 43-48页 [查看摘要][在线阅读][下载 901K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：145 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：9 ] - 张经伟;李琦;陈宗艳;宫晓华;李国新;温建新;朱杰;李传峰;刘光清;
为研究新型鸭细小病毒(Novel duck parvovirus,NDPV)NS1蛋白的生物学功能,根据NDPV DS15株NS1基因(Gen Bank登录号:KU947420)设计1对特异性引物,对NS1全基因进行PCR扩增,将PCR扩增产物克隆入pGEX-4T-1载体,构建重组质粒pGEX-4T-NS1,并进行测序鉴定。经鉴定正确后重组质粒转化到BL21感受态细胞,SDS-PAGE和Western blot进行表达鉴定。将测序获得NS1基因编码蛋白进行生物信息学分析。结果显示,本研究构建的重组质粒可在原核细胞中成功表达97kDa的NS1融合蛋白。进一步生物信息学分析结果显示,NS1蛋白为酸性、可溶性蛋白,由627个氨基酸组成,分子质量约为72kDa。该蛋白主要位于胞浆,不含信号肽序列,无跨膜区,含有丝/苏氨酸激酶底物模序和1个潜在磷酸化位点(s546),抗原表位主要集中在多肽的C端。NS1基因的同源性及系统发生树分析表明,NDPV与鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)处于同一进化分支,遗传进化关系最近。本研究结果为揭示NDPV NS1在病毒的复制、增殖以及致病机制中的作用奠定了基础。
2017年02期 v.25;No.116 49-55页 [查看摘要][在线阅读][下载 895K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：238 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：16 ] - 钟丽;孙美玉;高立;刘永振;李凯;祁小乐;高玉龙;王笑梅;
根据本实验室分离禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)毒株和GenBank中已发布ARV标准毒株σC基因序列比对结果,在保守区域设计1对引物和1条特异性TaqMan探针。通过对反应条件和反应体系的优化,建立的Real-time RT-PCR在1×10~1~1×10~(10) copies/μL范围内具有良好的线性关系,灵敏度达到10 copies/μL,是常规PCR方法的100倍。本研究建立的RTPCR与其他禽病病原无交叉反应,且批间与批内重复性试验变异系数分别小于1%和2%,表明该方法具有良好的特异性和重复性。将本实验室分离流行毒株MS01和标准毒株S1133感染SPF鸡后,利用建立的Real-time RT-PCR对ARV在鸡体内组织脏器的分布及病毒载量进行比较研究,结果表明,毒株MS01及S1133对SPF鸡的致死率分别为80%和46.7%,两株病毒均能在肝脏、脾脏、肺脏中有效复制,毒株MS01病毒载量明显高于毒株S1133,但与毒株S1133不同,毒株MS01在肾脏组织中也能有效复制。本研究不仅为禽呼肠孤病毒的诊断提供了技术手段,也有利于进一步探索流行毒株MS01高致病性的分子机制。
2017年02期 v.25;No.116 56-60页 [查看摘要][在线阅读][下载 793K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：240 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ]