- 陈蓉;郝飞;谢星;赵琳;韦艳娜;张磊;王丽;熊琪琰;邵国青;冯志新;
本研究旨在以猪肺炎支原体为代表，研究支原体LAP酶活中心的高级结构及其被抑制后对支原生长的影响。亮氨酸氨肽酶(LAP)是一类广泛存在于各类生物的氨基酸代谢酶，有研究表明病原微生物的LAP酶活中心被抑制后可以直接影响微生物的代谢和生长。本研究拟以猪肺炎支原体(Mhp)LAP为模型，研究其理化特性和高级结构，探索LAP抑制剂乌苯美司(Bestatin)对支原体生长的影响。本研究首先用Clustal Omega进行序列同源性比较，分析LAP活性位点在不同支原体中的保守情况。然后采用GST融合标签表达猪肺炎支原体LAP蛋白，通过GST亲和层析和分子筛层析纯化蛋白，圆二色谱测定LAP的二级结构，用Alpha fold 2预测三级结构。最后用Bestatin与猪、鸡、羊等不同种属的支原体共培养来观察其影响。结果表明虽然总体序列同源性不高，但是LAP酶活中心的关键位点在常见支原体相对保守。猪肺炎支原体LAP可以通过GST标签进行可溶性表达。酶切GST标签后，分子筛层析显示LAP是六聚体，圆二色谱表明LAP具有正确的二级结构。预测的LAP三级结构显示其具有保守的底物结合关键位点。Bestatin对不同种属支原体的生长均产生抑制，且呈现剂量依赖性，但在不同菌株间存在差异，最低在6 μg/mL的浓度可通过抑制氨肽酶的活性抑制猪肺炎支原体的生长。该研究为新一代抗菌药物的研发提供了新的思路。
2024年02期 v.32;No.158 1-11页 [查看摘要][在线阅读][下载 1972K] [阅读次数：35 ] |[下载次数：288 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] - 谭敏;杨丹娇;汪露;黄志宏;陈朝喜;
采用改良结晶紫半定量法和微量肉汤稀释法分别对152株大肠杆菌进行生物被膜形成能力分析和12种常用抗菌药物敏感性试验。同时，利用棋盘稀释法评价四种藏兽医药用植物(马蹄黄、偏翅唐松草、华丽龙胆和岩生忍冬)不同提取部位(甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和石油醚)、屎肠球菌乙酸乙酯提取物与高耐药率抗生素(氯霉素、土霉素、氨苄西林和磺胺甲噁唑)联合对10株多重耐药大肠杆菌(E1-E10)杀菌活性，以探讨不同药物组合对E6生物被膜的清除作用。实验结果显示：152株大肠杆菌多表现为中等成膜能力和无成膜能力表型，对氯霉素、磺胺二甲嘧啶、土霉素、氨苄西林、磺胺甲噁唑的耐药率均高于90%，对二氟沙星、环丙沙星、阿米卡星、头孢噻呋、妥布霉素和头孢曲松的耐药率均低于50%，其中阿米卡星的敏感率最高，耐药率仅为19.90%；马蹄黄甲醇提取物、偏翅唐松草乙酸乙酯提取物、华丽龙胆甲醇提取物和岩生忍冬乙酸乙酯提取物、屎肠球菌S16和S17乙酸乙酯提取物对E1～E10的MIC范围分别为3.93～15.63、3.93～31.52，7.81～15.63、7.81～31.52、0.42～13.38和0.45～3.63 mg/mL；四种藏兽医药用植物不同提取部位和屎肠球菌乙酸乙酯提取物与高耐药率抗菌药物分别呈现不同的联合作用；在MIC浓度下，药物联合对E6表现出较强的生物被膜清除能力，其中岩生忍冬和偏翅唐松草乙酸乙酯提取物与土霉素和氨苄西林联用对E6生物被膜的抑制率高于其他组合，岩生忍冬和偏翅唐松草乙酸乙酯提取部位与土霉素联用的抑制率分别为48.92%、42.58%，与氨苄西林联用的抑制率分别为48.58%、47.84%。选用的四种藏兽医药用植物、益生菌和抗菌药物联合应用在一定程度上能够解决本研究藏猪和藏鸡源大肠杆菌耐药性和生物被膜形成等问题。
2024年02期 v.32;No.158 12-20页 [查看摘要][在线阅读][下载 1418K] [阅读次数：13 ] |[下载次数：285 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] - 李秀丽;王利丽;李富强;田向学;路超;任卫科;江珊;张莉;鄢明华;
为探讨禽腺病毒4型分离株Y17215-1的体外增殖特性和免疫原性，本研究以LMH细胞为模型，摸索Y17215-1株最佳接种剂量和收获时间；通过活毒滴鼻接种和灭活疫苗肌肉注射的方式免疫SPF鸡，测定其免疫原性。结果显示：Y17215-1株0.1 MOI接种LMH细胞，培养48～72 h病毒滴度达到峰值10~(8.625) TCID_(50)/mL。该病毒经肌肉注射对42日龄SPF鸡具有较强致病性，LD_(50)为10~(3.000) TCID_(50)/0.2 mL。以10~(7.676) TCID_(50)的Y17215-1株滴鼻免疫21日龄SPF鸡，免疫后7 d 100%试验鸡产生中和抗体，14 d达到高峰。以Y17215-1株制备灭活疫苗肌肉注射免疫21日龄SPF鸡(10~(7.676) TCID_(50)/羽)，免疫后7 d 70%试验鸡产生中和抗体，21 d达到高峰。在免疫后21 d用1000LD_(50)的Y17215-1株进行攻毒，活毒和灭活疫苗的保护率均为100%。以上结果表明：Y17215-1株具有很好的体外增殖特性和免疫原性，可以作为候选疫苗毒株。
2024年02期 v.32;No.158 21-26页 [查看摘要][在线阅读][下载 1435K] [阅读次数：14 ] |[下载次数：236 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] - 钟华;刘金凤;陈冰;覃绍敏;陈凤莲;马玲;林俊;毛燕;秦树英;白安斌;
探讨通过凋亡抑制剂阻断PRRSV诱导的细胞凋亡来促进PRRSV体外复制，从而提高PRRSV体外培养滴度的可行性。本研究以PRRSV高致病毒株(HP-PRRSV)感染Marc-145细胞，并用三种凋亡抑制剂(Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK、Z-LEHD-FMK)分别处理PRRSV感染细胞，通过比较在不同的浓度、不同的作用时间处理下PRRSV培养滴度(TCID_(50))来筛选最佳抑制剂及其最佳使用浓度和作用时间。同时采用caspase-8活性蛋白酶检测试剂盒、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、流式细胞术等检测在最佳抑制剂作用下caspase-8活性、细胞凋亡及其通路相关因子表达情况。结果显示：z-IETD-FMK(caspases-8特异性抑制剂)为最佳抑制剂，10 μmol/L为最佳使用浓度，PRRSV感染细胞48 h后加入10 μmol/L Z-IETD-FMK能最大限度提高PRRSV体外培养滴度。此外，PRRSV感染Marc-145细胞后，细胞caspase-8活性显著增加，且随着感染时间的延长，细胞凋亡率及促凋亡因子Bax均呈上升趋势，而抑凋亡因子Bcl-2表达水平却呈下降趋势；用抑制剂z-IETD-FMK处理后，细胞caspases-8活性下调，细胞凋亡率也下降，Bax表达量显著低于不加抑制处理的病毒感染组(P<0.01)，与此相反Bcl-2的表达水平为升高趋势，显著高于不加抑制处理的病毒感染组(P<0.01)。说明，caspase-8特异性抑制剂能有效抑制PRRSV诱导的细胞凋亡。结果提示HP-PRRSV感染可通过caspase-8途径诱导Marc-145细胞凋亡，从而抑制病毒的复制。使用caspase-8特异性抑制剂可有效抑制细胞凋亡，进而提高病毒体外培养滴度。
2024年02期 v.32;No.158 27-34页 [查看摘要][在线阅读][下载 1501K] [阅读次数：10 ] |[下载次数：221 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] - 梁桂星;张文婷;汪最;张腾飞;郭云清;卢琴;罗青平;杨玉莹;
鸡白痢沙门菌和金黄色葡萄球菌是危害家禽养殖业和公共卫生的重要病原菌，生物被膜的形成是其持续和反复感染的重要原因。为探究没食子酸对二者生物被膜形成的影响，本研究采用微量稀释法测定没食子酸对鸡白痢沙门菌CVCC519和金黄色葡萄球菌ATCC 25923的最小抑菌浓度MIC、最小杀菌浓度MBC，共孵育测定最小生物被膜抑制浓度(MBIC)和最小生物被膜清除浓度(MBEC)；采用结晶紫染色和硫酸-苯酚法分别测定其对试验菌生物被膜及胞外多糖(EPS)的抑制率，并利用环境扫描电镜观察生物被膜形态；最后采用qRT-PCR方法检测其对试验菌生物被膜形成相关基因表达量的影响。结果显示，没食子酸对CVCC519和ATCC 25923的MIC分别为4 mg/mL和8 mg/mL，MBC分别为8 mg/mL和16 mg/mL，MBIC均为8 mg/mL，MBEC均为16 mg/mL。此外，没食子酸在不显著影响试验菌生长的浓度下，能有效抑制其生物被膜形成和EPS的产生。环境扫描电镜观察发现，没食子酸处理使生物被膜生成量显著减少，结构松散、变薄。qRT-PCR检测结果显示，没食子酸在不显著影响试验菌生长的浓度下，能显著抑制CVCC519菌毛基因csgA、csgD，纤维素基因bcsA、adrA，群体感应系统相关基因luxS的表达，而对ATCC 25923的ica操纵子和luxS并无显著调控作用。以上结果表明，没食子酸在不显著影响鸡白痢沙门菌生长的浓度下，可通过下调其生物被膜形成相关基因的表达，减少胞外基质的合成，产生抗生物被膜的作用；也能通过ica非依赖途径有效抑制金黄色葡萄球菌胞外多糖的分泌和生物被膜的形成。本研究为没食子酸防控鸡白痢沙门菌和金黄色葡萄球菌生物被膜提供理论基础。
2024年02期 v.32;No.158 35-42页 [查看摘要][在线阅读][下载 1654K] [阅读次数：11 ] |[下载次数：800 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] - 杨雪;任善会;王相伟;龚真莉;殷相平;孙跃峰;陈豪泰;万学瑞;
羊睾丸原代细胞的体外培养是探究牛羊病毒致病机理的重要材料，实际科研工作中常受困于此类细胞传代性差、性质不稳定等缺点。外源性导入人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)可以促使端粒酶活性的表达，延长细胞体外培养寿命是一种有效建立细胞永生化的方法。本试验中，通过RT-PCR获得hTERT。利用同源重组的技术，成功的构建了hTERT的真核表达质粒和慢病毒质粒。利用慢病毒表达系统，建立了稳转hTERT绵羊的睾丸细胞系。间接免疫荧光和蛋白免疫印迹试验研究结果均显示，hTERT基因已成功整合进入绵羊睾丸基因组中并稳定表达。第30代次的羊睾丸细胞生长较快，性状较稳定，表明已成功构建了具有永生化特性的绵羊睾丸细胞系，为草食动物病毒的相关研究提供重要的细胞模型。
2024年02期 v.32;No.158 43-48页 [查看摘要][在线阅读][下载 1453K] [阅读次数：6 ] |[下载次数：523 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] - 陈晓;李伟国;宋欢欢;苏晓蕊;王同燕;谭菲菲;田克恭;
为建立一套表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒反应器工艺，提高反应器上猪瘟病毒E2蛋白的表达量，以商业化培养基为基础，通过对关键营养组分添加量的DOE试验设计优化，获得一种组合补料配方，并在3 L反应器上对补料方式进行优化，以最大限度提高细胞密度。进一步在反应器上摸索了通气策略，以精确调控猪瘟E2重组杆状病毒培养过程的营养代谢平衡，解决副产物乳酸和氨过度积累导致细胞活力下降的问题。首次使用半连续补料工艺与渗透压动态平衡相结合的补料策略以及定向调节通气的工艺模式，使猪瘟病毒E2蛋白的表达量由130 mg/L增加至520 mg/L，提高了3倍。将3 L反应器工艺在100 L反应器上进行了连续3个批次的验证，结果猪瘟病毒E2蛋白的表达量均大于500 mg/L，收获猪瘟E2蛋白制备的疫苗抗体均在2周后转阳，且抗体水平持续上升，接种后8周抗体阻断率仍维持在80%左右。综上，3 L反应器工艺能够稳定放大至100 L反应器，建立了表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒100 L反应器工艺，且100 L反应器上重组蛋白的表达量稳定、免疫原性良好。
2024年02期 v.32;No.158 49-57页 [查看摘要][在线阅读][下载 1434K] [阅读次数：6 ] |[下载次数：306 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] - 齐新永;王晓旭;鞠厚斌;赵洪进;刘健;陆雪林;孙泉云;徐锋;沈莉萍;王建;
为探讨羊源性伪狂犬病病毒分离株SH1407对湖羊的致病性。将7只健康湖羊随机分成试验组和对照组，其中试验组5只，对照组2只。用分离株SH1407对试验组湖羊进行人工攻毒，取发病死亡羊内脏组织用于组织病理学检查和免疫组化分析。湖羊在攻毒后3 d开始出现症状，第4 d症状进一步加剧，表现为局部奇痒、体温升高、精神沉郁、食欲废绝等症状，4只发病死亡，存活1只，死亡率达到80%。剖检主要表现为脑膜充血，肺淤血，轻度实变。病理组织学检查：大脑、延髓神经元变性，细胞核溶解、消失，呈病理性细胞凋亡；肺脏呈间质性肺炎病变；脾脏、肾脏出血。免疫组化染色显示，PRV在肝脏、肺脏、大脑、脾脏等组织器官广泛存在，病毒在肝脏中主要存在于库弗氏细胞中，在肺脏中主要存在于Ⅱ型肺泡细胞中，在脾脏中主要存在于巨噬细胞、单核细胞中，而在脑组织中，神经元呈现较强的信号，说明病毒主要存在于神经细胞中。实时荧光定量PCR测定内脏器官病毒载量，肝脏、脾脏、肺脏和脑组织中PRV大量增值，其中PRV在脑组织中大量增值导致中枢神经严重的病理改变。
2024年02期 v.32;No.158 58-64页 [查看摘要][在线阅读][下载 1886K] [阅读次数：6 ] |[下载次数：228 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] - 闫彩虹;金文杰;刘文博;羊扬;钱琨;王志强;彭大新;
为了解国内鸡群马立克病毒(MDV)流行毒株的分子特征，采用细胞培养法对马立克病疑似病鸡抗凝血进行MDV分离，间接荧光法鉴定MDV血清型，PCR扩增分离病毒的meq和pp38两个主要致病基因，所得序列与MDV参考毒株的序列进行比对分析。结果显示，共分离鉴定出2株MDV I型毒株，分别命名为JS0316和JS0424。meq基因编码的氨基酸序列结果显示，2个MDV分离株缺乏弱毒疫苗株的特征(A71S、P194-)，具有MDV强毒分离株的分子特征(D80Y、V115A、T139A、P176R和P217A)。同时，JS0316 Meq蛋白出现Q93R和V123A突变，pp38蛋白出现L98I和F240S突变，而JS0424 Meq蛋白出现P217T突变，pp38蛋白出现W67G和V210A突变。因此，2株MDV均具有国内流行强毒株的分子特征，同时存在新的基因突变。
2024年02期 v.32;No.158 65-72页 [查看摘要][在线阅读][下载 1673K] [阅读次数：16 ] |[下载次数：512 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] - 郭长明;陈怀君;袁橙;袁圣;贾国华;王义仁;朱善元;
本研究旨在明确当前罗非鱼无乳链球菌流行状况和生物学特性，为鱼源无乳链球菌病防控提供新的数据。本研究于2019—2020年，从广东罗非鱼主养区茂名、湛江地区采集病样进行无乳链球菌的分离鉴定。用PCR方法对分离株血清型及4个主要毒力基因进行检测，通过纸片法对分离菌株进行31种抗菌药物药敏试验和多重耐药研究，利用斑马鱼模型进行了致病性试验。结果显示：从261份病样中分离到35株无乳链球菌；血清型检测表明无乳链球菌分离株的血清型均为Ia型；主要毒力基因的检测证明，cylE、sodA、gapC基因在所有鱼源分离株及人源、牛源和鱼源参考株中检出率均为100%，而scpB只在人源参考菌株中检出；药敏试验结果发现，无乳链球菌分离株对19种抗菌药敏感率为90%以上，对6种抗菌药耐药率为50%以上，分离株的耐药基因型和表型部分一致，无乳链球菌分离株均多重耐药，其中5重及以上耐药的菌株为27株，占总菌株数的77.1%；斑马鱼致病试验表明，无乳链球菌分离株可导致斑马鱼不同程度的发病死亡。本研究明确了当前罗非鱼源无乳链球菌的血清型、毒力基因、耐药特性和致病性，为广东乃至全国罗非鱼无乳链球菌病的防控提供了参考。
2024年02期 v.32;No.158 73-82页 [查看摘要][在线阅读][下载 1462K] [阅读次数：6 ] |[下载次数：784 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] - 王艳;孙文渊;朱维;王峰升;孟德坤;
近几年，鸡传染性法氏囊病毒新型变异株在我国广泛流行，主要发生于肉鸡，其致病力弱、隐蔽性强但能造成法氏囊严重萎缩。本研究从山东济宁地区临床出现法氏囊萎缩的发病麻鸡中采集法氏囊病料，接种SPF鸡胚进行病毒分离，通过RT-PCR方法进行病毒鉴定，将分离毒株回归SPF鸡进行致病性试验，同时对其主要抗原基因VP2进行进化分析。结果发现，该毒株能致死鸡胚；对其VP2基因进行测序比对和进化树分析发现，其与近几年的新型变异株基因序列的进化关系较近，同源性为96.1%～99.2%；人工感染SPF鸡第7 d法氏囊即出现较为明显的萎缩，第14 d萎缩更为明显，囊体比显著小于对照组(P<0.01)。本研究分离到的麻鸡源传染性法氏囊病毒JN22株属于新型变异株，能导致SPF鸡法氏囊显著萎缩。
2024年02期 v.32;No.158 83-88页 [查看摘要][在线阅读][下载 1461K] [阅读次数：7 ] |[下载次数：371 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] - 费世港;刘合永;王叶元;冯敏;王子龙;孙京臣;
本研究旨在为了解江西某蜂场蜜蜂是否感染中蜂囊状幼虫病病毒(CSBV)并探究CSBV感染中蜂幼虫后的应答反应。采集该蜂场疑似感染CSBV的蜜蜂，采用RT-PCR的方法检测CSBV核酸，取阳性的蜜蜂样品进行病毒分离纯化、电镜观察及测序。将纯化鉴定后的CSBV对3日龄的中蜂幼虫进行人工感染，进行转录组测序，分析中蜂幼虫感染CSBV的应答反应。通过RT-PCR验证和电镜观察成功鉴定CSBV，并命名为CSBV-JX。CSBV-JX电镜观察直径为25～30 nm。对其进行分段扩增测序，发现基因组序列为8781 bp，对其进行系统发育分析，表明东方蜜蜂的SBV(AcSBV)与西方蜜蜂的SBV(AmSBV)明显分为两个分支，具有较强的地域分化性。转录组测序分析发现，中蜂幼虫在感染CSBV-JX后2 h有59个基因上调表达，83个基因下调表达；感染后12 h有68个基因上调表达，86个基因下调表达。本研究成功分离鉴定一株中蜂囊状幼虫病毒并命名为CSBV-JX。同时对CSBV-JX感染中蜂幼虫的转录组学分析发现，CSBV-JX感染2 h和12 h引起宿主的响应较小，这可能是CSBV-JX感染的2 h和12 h为病毒增殖的早期阶段病毒载量低，引起的宿主免疫响应小所导致。在CSBV-JX感染中蜂幼虫的2 h和12 h期间引起的差异基因与代谢通路关联较大，研究结果为阐明解析CSBV感染中蜂的分子机制提供了基础。
2024年02期 v.32;No.158 89-96页 [查看摘要][在线阅读][下载 1934K] [阅读次数：8 ] |[下载次数：199 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] - 孙艳永;杨德洪;徐瑞;陈宁;
本试验旨在评估牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗对4～6月龄犊牛的安全性。12头4～6月龄犊牛随机分成3组，每组4头，各组分别肌肉注射牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗、牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗或疫苗稀释液，2 mL/头。试验结果表明，免疫后所有试验用牛无牛病毒性腹泻病毒引起的发热和临床症状，也不引起白细胞水平的下降；仅1头牛在免疫牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失疫苗后第7 d检测到病毒血症和鼻腔排毒，在其他时间点均为阴性。所有犊牛均无大体病理学和组织病理学变化。综上所述，牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因弱毒疫苗对4～6月龄的犊牛安全性良好。
2024年02期 v.32;No.158 97-105页 [查看摘要][在线阅读][下载 1583K] [阅读次数：2 ] |[下载次数：178 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] - 虞凌雪;姜一峰;杨莘;于海;周艳君;童武;高飞;李国新;刘长龙;郑浩;单同领;李丽薇;孔宁;童光志;
为研究表达猪源粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在动物体内的免疫调节特性及对其的保护效力评价，本研究将15头30日龄仔猪随机分成4组，空白对照组(DMEM)4头、疫苗对照组(HuN4-F112株)4头、疫苗组(rPRRSV-GM-CSF株)3头和攻毒对照组(DMEM+HuN4株)4头。疫苗对照组肌注免疫HuN4-F112株10~5 TCID_(50)/头、疫苗组肌注免疫rPRRSV-GM-CSF株10~5 TCID_(50)/头，实验空白组和攻毒对照组肌注DMEM 2 mL/头，免疫后28 d，疫苗组、疫苗对照组和攻毒对照组肌注HuN4株(10_5 TCID_(50)/头)。攻毒后的试验结果表明，免疫rPRRSV-GM-CSF重组病毒组和疫苗株HuN4-F112组获得完全保护，阴性对照组全部死亡；通过IDEXX试剂盒检测仔猪血清中PRRSV抗体水平可知，在免疫14 d后，疫苗组抗体水平显著高于疫苗对照组(P<0.05)；由流式细胞术分析体内免疫细胞亚群比例可知，疫苗组同疫苗对照组相比，疫苗组的重组疫苗株能够引起免疫记忆细胞亚群CD4~+CD8~+T在免疫后28 d显著升高，以及引发攻毒后其抗原递呈细胞显著增多，进而促进CD4-CD8~+T的增殖以发挥抗病毒免疫应答。本研究筛选出了一株具有改善HuN4-F112弱毒疫苗株免疫效果的重组病毒rPRRSV-GM-CSF，为进一步研发广谱通用的新型疫苗奠定基础。
2024年02期 v.32;No.158 106-112页 [查看摘要][在线阅读][下载 1483K] [阅读次数：8 ] |[下载次数：326 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] - 李昱昊;刘昱男;张妍;管志欣;张俊杰;肖长广;李宗杰;李蓓蓓;邵东华;刘珂;邱亚峰;马志永;孙尧;魏建超;
养殖场中滋生的大量蚊蝇可以在畜禽之间和人畜之间传播蚊媒病毒，不仅会对养殖场造成经济损失，而且还会严重威胁人类健康。本试验为了观察三种复方植物精油在实验室驱蚊的效果。我们根据国标GB/T 13917.9-2009规定的攻击力试验方法，通过使用小鼠模型来测定三种复方植物精油对白纹伊蚊的驱避时效。本试验结果显示在该试验中，以白纹伊蚊作为本次试验蚊虫，两种驱蚊花露水在2 h以内对昆明小鼠有效保护率在70%以上；复方植物精油(APEX)在2 h内对昆明小鼠的有效保护率达到40%；通过调整植物精油成分，复方植物精油(APEX-1)对昆明小鼠有效保护时间为2 h，而且在4 h内有效保护率均可达到80%以上；复方植物精油(APEX-2)型对昆明小鼠有效保护时间为2 h，而且在4 h内有效保护率均可达到90%以上。结果表明，复方植物精油(APEX)是一种有效的蚊蝇驱避剂，通过调整植物精油成分后，有效保护率达到80%以上，其高效绿色环保的优势在养殖场蚊蝇驱避方面有较大应用前景。
2024年02期 v.32;No.158 113-117页 [查看摘要][在线阅读][下载 1341K] [阅读次数：3 ] |[下载次数：797 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] - 刘影;闫若潜;王东方;杨海波;赵美雪;宋丹;赵雪丽;谢彩华;王淑娟;马震原;柴茂;王翠;刘梅芬;
建立一种特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法，用于非洲猪瘟病毒(ASFV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的鉴别诊断。针对ASFV的B646L基因和HP-PRRSV的NSP2基因分别设计特异性引物/探针对，经优化反应体系、反应程序等反应条件，建立一种基于探针技术的FQ-PCR方法，验证方法的敏感性、特异性和重复性，对130份临床样品进行检测，并与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)进行比较分析。本研究成功建立的ASFV和HP-PRRSV二重FQ-PCR检测方法在10~(-1)～10~5 copies/μL模板范围内有良好的线性关系；对ASFV和HP-PRRSV基因出现阳性扩增，但对猪日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲经典株(VR2332株)、健康猪脾脏等7种病原核酸样品对照未出现扩增；批内、批间试验变异系数在0.53%～3.14%，重复性良好；对ASFV和HP-PRRSV的最低检测模板浓度均为10 copies/μL；利用建立的二重FQ-PCR方法对130份临床样品进行检测，检测结果与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和HP-PRRSV二重FQ-PCR检测方法，为ASFV和HP-PRRSV的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。
2024年02期 v.32;No.158 118-130页 [查看摘要][在线阅读][下载 1426K] [阅读次数：11 ] |[下载次数：713 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] - 盛陈艳;麻宝艺;李健明;宫庆龙;刘菲;时坤;孙志博;刘艺;冷雪;杜锐;
为快速检测水貂圆环病毒(MiCV)，本试验根据MiCV Cap基因序列设计合成特异性引物，建立了水貂圆环病毒SYBR Green II实时荧光定量PCR检测方法。结果显示，该方法在模板浓度为1.0×10~6 ～1.0×10~1 copies/μL范围内呈良好线性关系，相关系数为0.9983。本试验建立的检测方法对水貂阿留申病毒、猪圆环病毒2型、水貂肠炎病毒、犬瘟热病毒和猪伪狂犬病毒进行检测均无特异性扩增，批内和批间CV均小于2%，对重组阳性质粒的检测下限为1.0×10~1 copies/μL，比普通PCR的敏感度高100倍，对阳性样品DNA的检测下限为2.38×10~(-2) pg/μL，比普通PCR的敏感度高1000倍。应用该方法对吉林省部分毛皮动物养殖场的水貂、狐狸、貉和环境样品进行检测，结果其阳性率分别为57.23%、48.42%、39.71%和68.48%。上述结果表明，本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性，为MiCV的诊断及流行病学调查提供技术支持。
2024年02期 v.32;No.158 131-138页 [查看摘要][在线阅读][下载 1492K] [阅读次数：3 ] |[下载次数：561 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] - 袁野;董雅琴;张慧;刘爽;崔进;尼博;魏荣;顾丛丛;段纲;张锋;李晓成;代飞燕;
为建立一种牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的快速检测方法，本研究根据国内BVDV流行毒株5'-UTR序列保守区域设计1对特异性引物和TaqMan探针，并优化了反应条件，最终建立了一种检测BVDV基因1型(BVDV-1)的TaqMan探针荧光RT-PCR检测方法，并开展7省份BVDV-1型检测和流行情况分析。结果显示：所建立方法能够特异性检测出BVDV-1，与基因2型BVDV、猪瘟病毒、边界病毒、牛冠状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒等病原无交叉反应；灵敏度高，最低检测下限为4.3 copies/μL；批内和批间变异系数均小于2%，重复性良好。7省份规模化牛养殖场BVDV-1型平均阳性率为17.40%(161/925)，序列分析表明我国主要流行的为BVDV-1a，BVDV-1c亚型。本研究成功建立了一种良好的诊断BVDV的方法，监测地区优势流行毒株为BVDV-1a与1c亚型，为临床中BVDV早期诊断和流行病学调查监测提供了技术和数据支持。
2024年02期 v.32;No.158 139-145页 [查看摘要][在线阅读][下载 1481K] [阅读次数：5 ] |[下载次数：453 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] - 刘存;刘孟超;张月;王晓玲;赵梦姣;李云岗;兰邹然;孙圣福;刘砚涵;
为了建立牛结节性皮肤病病毒(LSDV)的快速诊断方法，本试验依据LSDV GCPR基因的保守序列区域设计了荧光定量PCR的引物和探针，并建立了快速诊断LSDV的荧光定量PCR方法。结果表明，建立的LSDV荧光定量PCR方法在3.67×10~1 ～3.67×10~7 copies/μL拷贝标准品间具有良好的线性关系，线性相关系数达0.9905；该方法具有良好的敏感性，其检测病毒系列含量下限为3.67×10 copies/μL；该方法特异性良好，与山羊痘病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒等病毒不存在交叉反应；该方法重复性较好，批内和批间的变异系数均介于0.133%～1.81%。该方法，临床样品的检测符合率达90%。本试验所建立的LSDV荧光定量PCR方法为临床诊断牛结节性皮肤病提供了一种快速、灵敏的检测方法，为LSDV流行病学调查和监测提供了技术支持。
2024年02期 v.32;No.158 146-150页 [查看摘要][在线阅读][下载 1464K] [阅读次数：7 ] |[下载次数：739 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] - 李桐;赵润泽;李博天;李春琪;王妍;郭利伟;杨小林;刘国平;
为快速检测并鉴别猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)病毒。本文研究参考GenBank中PCV2和PCV3高度保守片段分别设计了探针引物，成功建立了一种双重TaqMan荧光定量检测方法。结果显示：该方法特异性好，可鉴别 PCV2、PCV3与其他猪病病毒；PCV2最低检测下限为1.00×10~1 copies/μL，PCV3最低检测下限为1.00×10~0 copies/μL；重复性高，批内、批间的变异系数分别为0.01%～0.02%和0.02%～0.05%；本研究采用建立的方法与商品试剂盒同步检测猪只样品440份，PCV2样品符合率为97.47%，PCV3样品符合率为96.85%；测序结果显示，PCV2均为2d亚型，PCV3均为3c亚型。结果表明，建立的双重TaqMan荧光定量检测方法具有良好的特异性、敏感性且快速、准确，节约成本，可为PCV2和PCV3的监测与防控提供技术支撑。
2024年02期 v.32;No.158 151-159页 [查看摘要][在线阅读][下载 1540K] [阅读次数：7 ] |[下载次数：481 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] - 田万年;迟雪;袁世超;郭小雨;
为建立一种能快速对卵形巴贝斯虫(Babesia ovata)和中华泰勒虫(Theileria sinensis)同时进行检测的双重PCR方法。根据GenBank已报道的卵形巴贝斯虫AMA1基因和中华泰勒虫MPSP基因设计合成了2对特异性引物，通过条件优化，建立了双重PCR检测方法。结果显示：双重PCR可特异扩增出卵形巴贝斯虫和中华泰勒虫目的条带，片段大小分别为500 bp和986 bp。该方法具有较好的特异性，对卵形巴贝斯虫和中华泰勒虫的最低检出浓度为16 fg/μL。对采集的90份牛血液样本进行双重PCR检测，卵形巴贝斯虫阳性率为30%(27/90)，中华泰勒虫阳性率为16.67%(15/90)，混合感染率为10%(9/90)。结果表明，双重PCR方法可用于卵形巴贝斯虫和中华泰勒虫的快速诊断和流行病学调查。
2024年02期 v.32;No.158 160-164页 [查看摘要][在线阅读][下载 1290K] [阅读次数：6 ] |[下载次数：186 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] - 赵雪丽;闫若潜;王华俊;王淑娟;马震原;谢彩华;柴茂;杨海波;王翠;刘影;王东方;
建立一种快速、特异鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重TaqMan MGB探针FQ-PCR方法，本研究以PCV2的Rep蛋白和PCV3的Cap蛋白基因作为靶基因，各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针，经优化各反应条件和进行敏感性、特异性、重复性和干扰性试验，建立鉴别检测PCV2/PCV3的双重FQ-PCR方法。结果显示：该方法可特异性扩增PCV2、PCV3核酸，与猪伪狂犬病病毒(PRV)等8种病原及阴性对照无交叉反应，特异性较强；对PCV2和PCV3阳性质粒标准品的最低检出限均可达10 copies/μL，敏感性较高；PCV2/PCV3批内/批间重复试验变异系数(CV)值均在3%以下，表明方法稳定性、重复性较好；干扰性试验表明在两种病毒阳性质粒起始模板相差较大时该方法不会影响对其中任一病毒核酸的检出和准确定量。对42份临床疑似PCV感染样品检测结果与PCV2 、PCV3基因测序结果符合率100%。本研究建立的双重FQ-PCR方法具有敏感性高达10 copies/μL、特异性强、在同一反应体系中能同时快速鉴别检测PCV2、PCV3等优点，可用于临床PCV2/PCV3感染的快速鉴别检测。
2024年02期 v.32;No.158 165-173页 [查看摘要][在线阅读][下载 1445K] [阅读次数：8 ] |[下载次数：356 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] - 董苏洁;孔宁;秦文珍;翟焕杰;翟雪滢;杨心雨;童武;郑浩;于海;童光志;李有文;单同领;
为了建立高效、灵敏的猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法，本研究从GenBank数据库中获取PEDV N基因序列，扩增出PEDV N基因标准质粒，并在N基因的保守区域内设计了一对特异性荧光定量引物，成功建立了SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。经过一系列试验表明，该检测方法线性关系良好，R~2值为0.99；特异性强，敏感性高，最低可检测至2.23 copies/μL，比普通PCR灵敏约100倍；重复性好，组内变异系数为0.25%～0.43%，组间变异系数为0.67%～0.97%；对于各地区96份临床样品检测出PEDV阳性率为25%。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法为PEDV的临床诊断、流行病学调查以及定量研究提供了有效的检测工具。
2024年02期 v.32;No.158 174-180页 [查看摘要][在线阅读][下载 1421K] [阅读次数：6 ] |[下载次数：1206 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] - 邱永辉;周建卫;王潇宇;周琳怡;侯磊;戴贝凝;冯旭飞;刘爵;
本研究以猪流行性腹泻病毒(PEDV)全基因组为模板，利用RT-PCR方法扩增PEDV S基因的亲水区，将其克隆至pMAl-c2E原核表达载体，获得重组质粒pMAl-c2E-PEDV-S。经EcoRⅠ/SalⅠ双酶切测序鉴定后，转化BL21菌，经IPTG诱导，成功表达了约74 kDa的重组蛋白MBP-PEDV-S，亲和层析法纯化重组蛋白。将重组蛋白免疫3只健康的6～8周龄雌性BALB/c小鼠，将小鼠脾脏B淋巴细胞与SP2/0瘤细胞融合，采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株，获得了4株能稳定分泌抗PEDV S蛋白抗体的杂交瘤细胞株1B11、1B10、1C8、3L3，其腹水效价都高于1∶100 000。获得的4株单克隆抗体与PEDV经IFA和Western blot检测，结果显示均具有良好的反应性。而且3株单克隆抗体重链为IgG2a，1株重链为IgG2b；3株轻链为Kappa，1株轻链为Lambda。本研究表达了PEDV S蛋白并制备了单克隆抗体，为研究S蛋白的结构和功能提供了条件，为揭示PEDV致病机制奠定了基础。
2024年02期 v.32;No.158 181-187页 [查看摘要][在线阅读][下载 1436K] [阅读次数：17 ] |[下载次数：1159 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] - 杜楠楠;陈金霞;曹云雷;张宽;童武;李丽薇;赵冉;童光志;高飞;
本研究利用PCR方法从非洲猪瘟病毒的灭活样品中扩增出747 bp的E248R基因全长序列，利用同源重组法构建原核表达质粒pCold I-pE248R，经1 mmol/L的IPTG诱导1 h后，利用SDS-PAGE对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析，表达蛋白的分子量约为32 kDa，利用纯化后得到pE248R重组蛋白作为免疫原经过4次免疫后制备鼠源抗pE248R多克隆抗体。利用该多克隆抗体检测实验室构建并拯救的已证明能够稳定表达ASFV pE248R蛋白的重组病毒rPRRSV-E248R，结果显示制备的抗pE248R的多克隆抗体能够与rPRRSV-E248R发生特异性结合反应，证明利用本试验中原核表达的pE248R蛋白制备的多克隆抗体具有抗pE248R蛋白的特异性，为进一步针对ASFV E248R基因建立快速，特异性的血清学检测方法奠定了基础，也为针对pE248R蛋白的功能性研究提供了研究基础。
2024年02期 v.32;No.158 188-194页 [查看摘要][在线阅读][下载 1385K] [阅读次数：11 ] |[下载次数：601 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] - 秦文珍;李挺;赵欣;董苏洁;翟焕杰;叶晨倩;叶曼青;童武;郑浩;于海;单同领;童光志;兰道亮;孔宁;
A型塞内卡病毒(SVA)是一种新兴的猪病原体，可引起母猪水泡样病变和仔猪急性死亡。本研究将SVA的VP1基因分别克隆到原核表达载体pCold-I和pCold-TF，并将测序正确的重组质粒VP1-pCold-I、VP1-pCold-TF转化BL21(DE3)大肠杆菌中，诱导表达重组蛋白。结果显示：VP1-pCold-I表达的目的蛋白在沉淀(包涵体)中，VP1-pCold-TF表达的蛋白为可溶性蛋白。分别纯化上述表达的蛋白，并免疫BALB/c小鼠，经四次免疫后得到多克隆抗体。经Western blot和间接免疫荧光(IFA)鉴定，制备的多克隆抗体具有良好的Western blot效价和IFA效价，为相关基础研究和应用研究提供了工具。
2024年02期 v.32;No.158 195-200页 [查看摘要][在线阅读][下载 1388K] [阅读次数：12 ] |[下载次数：600 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] - 戴爱玲;张鑫杰;林楚云;尹会方;薛少华;刘建奎;杨小燕;
为了了解2018—2020年福建地区猪瘟病毒流行及遗传变异情况，收集福建省不同地区临床发病猪的血液和肺脏、脾脏、淋巴结等组织样本1464份，采用RT-nPCR的方法对样品进行CSFV检测，对部分CSFV阳性样品E0基因进行克隆测序。结果显示，CSFV总体阳性率为1.9%(29/1464)，并获得13株CSFV E0基因序列。同源性分析发现所得13株CSFV E0基因之间的同源性在82.2%-99.7%，其中11株CSFV E0基因与1.1亚型代表毒株HCLV的核苷酸同源性为99.0%～99.9%，与Shimen株的核苷酸同源性94.1%～95.0%；1株与2.1c型参考毒株HNSD-2012核苷酸同源性为98.2%；1株与2.1d亚型毒株CSFV/JPN/2018核苷酸同源性为99.6%。遗传进化分析发现，10株CSFV与HCLV、C-ZJ-2008、Shimen和Brescia处于同一分支，属于1.1亚型；1株CSFV与HNSD-2012等位于同一分支，属于2.1c亚亚型；1株与CSFV/JPN/2018等位于同一分支，属于2.1d亚亚型。氨基酸序列分析发现，13株毒株与HCLV等代表毒株在重要的Rnase活性位点高度保守，其中2株2.1亚型毒株与HCLV毒株相比，其在第35位非关键氨基酸残基上发生由G→E的突变。结果表明福建地区CSFV流行情况趋向多样化，提示仍需加强对CSFV流行及遗传变异的持续监测，为猪瘟的诊断及有效防控奠定基础。
2024年02期 v.32;No.158 201-207页 [查看摘要][在线阅读][下载 1791K] [阅读次数：1 ] |[下载次数：217 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] - 赵婉宸;李扬;才天宇;葛志闯;高如一;王晓泉;顾敏;刘秀梵;
H3亚型流感病毒在自然界广泛存在，可感染人、猪、马、犬、禽等众多宿主并能发生跨种间传播，危害不容忽视。本研究于2019—2021年在华东地区活禽市场采集表观健康的家禽喉头与泄殖腔棉拭，通过血清学试验鉴定、筛选出6株代表性水禽源H3亚型流感病毒，并经RT-PCR试验确定5株为H3N2亚型、1株为H3N1亚型。进一步对6株分离株进行全基因组测序、同源性比对和遗传进化分析，结果显示：HA蛋白裂解位点处均为PEKQTR/GLF，不存在连续碱性氨基酸，符合低致病性禽流感病毒的分子特征；受体结合位点处均为禽源特征性的226Q和228S，提示其跨种传播至哺乳动物的潜能较低；内部基因片段来源多样化，与H3N8、H4N6、H5N8、H6N1、H7N7、H0N3等众多亚型禽流感病毒的亲缘关系密切；除JS1018/19和JS1094/19的NS基因属于北美谱系以外，其余均属于欧亚谱系的禽源分支，与犬、马、猪、人等哺乳动物源毒株的亲缘关系较远，提示虽然可能存在不同进化谱系间的基因重组但并未发生从禽到哺乳动物宿主的基因交换。该研究结果丰富了H3亚型禽流感病毒的流行病学数据，为进一步了解我国低致病性禽流感病毒的分布特征提供了参考依据。
2024年02期 v.32;No.158 208-217页 [查看摘要][在线阅读][下载 2692K] [阅读次数：3 ] |[下载次数：440 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ]