- 黄新月;谭磊;宋翠萍;仇旭升;孙英杰;刘炜玮;廖瑛;丁铲;吴艳涛;
新城疫病毒(NDV)可以通过多种内吞途径入侵不同宿主细胞并在内体中逃逸从而避免被宿主天然免疫系统“追踪”。为探究NDV中等毒力疫苗株Mukteswar感染鸡巨噬细胞(HD11)的入胞和胞内转运途径，本研究利用Dynasore、CPZ、MβCD、Baf A1预处理细胞，然后感染NDV Mukteswar株，通过Westem blot和IFA检测NDV NP蛋白的表达变化。结果显示Dynasore、MβCD和Baf A1处理后NP的表达水平降低，表明NDV入侵HD11细胞是利用小窝蛋白介导的内吞途径，且依赖动力蛋白、胆固醇和pH。通过过表达和干扰试验检测调节不同内体囊泡类型运输的Rab蛋白(Rab5、Rab7、Rab11)对NDV感染HD11细胞的影响，结果发现Rab7的表达对NDV感染无影响，而过表达Rab5和Rab11促进NDV感染，表明是由Rab5、Rab11而不是Rab7调节NDV的转运。本研究丰富了NDV入侵宿主免疫细胞的途径及胞内转运的研究，并为全面阐明NDV感染机制提供了理论基础。
2024年05期 v.32;No.161 1-10页 [查看摘要][在线阅读][下载 1623K] [阅读次数：50 ] |[下载次数：302 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] - 张思诗;姚亚文;朱顺海;赵其平;董辉;于钰;黄兵;韩红玉;
鸡球虫病是由几种艾美耳属寄生虫寄生引起的一种家禽肠道疾病。目前，对于该病控制仍然主要依赖于抗球虫药物，但长期广泛地使用药物造成了球虫耐药性的产生。为研究球虫耐药性产生的分子机制，本实验室前期对柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株、地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株以及敏感株进行了转录组测序并获得了敏感株与耐药株的差异表达基因，发现柔嫩艾美耳球虫保守蛋白35(EtCHP35)在盐霉素耐药株和马杜拉霉素耐药株mRNA转录水平显著上调。本研究以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA第一链为模板，成功克隆了柔嫩艾美耳球虫保守蛋白35(EtCHP35)基因，并在原核表达系统中成功表达了重组蛋白(rEtCHP3)。利用实时荧光定量PCR分析了该基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段以及不同虫株(敏感株和耐药株)的mRNA转录水平，结果显示EtCHP35基因在敏感株孢子化卵囊的mRNA转录水平最高；与敏感株相比，EtCHP35的mRNA转录水平在马杜拉霉素耐药株和盐霉素耐药株上调，但在地克珠利耐药株mRNA转录水平无差异，且随着盐霉素耐药株浓度的升高，EtCHP35的mRNA转录水平也升高。间接免疫荧光定位结果表明该蛋白主要分布在子孢子和第二代裂殖子的表面和顶部。因此，推测该蛋白可能参与了虫体在宿主体内的生长发育、对宿主细胞的识别附着、逃避宿主免疫应答以及球虫对离子载体类药耐药性产生的过程。
2024年05期 v.32;No.161 11-21页 [查看摘要][在线阅读][下载 1534K] [阅读次数：25 ] |[下载次数：206 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] - 朱姝桐;朱治坚;王陈君;郭旺;吴慧显;骆欢;胡序明;
钙结合蛋白S100A9是损伤相关分子模式蛋白家族的重要成员，在调节细胞的免疫功能和抗病毒免疫中扮演着重要角色。然而，目前尚不清楚S100A9在家禽中是否具有抗病毒功能。本文首先通过定量PCR分析发现ALV-J感染鸡巨噬细胞系HD11后持续性下调S100A9基因表达。为了进一步探讨S100A9基因在鸡巨噬细胞中的抗病毒功能及其机制，成功构建了S100A9真核表达载体。最后，通过定量PCR和Western blot检测S100A9过表达对ALV-J复制水平和TLR3信号通路相关基因表达的影响。结果显示：与对照组相比，ALV-J在过表达S100A9的HD11中的增殖水平显著降低。机制上，S100A9显著上调TLR3基因及其下游信号基因(IRF7、IFN-α和IFN-β)在HD11细胞中表达。本研究揭示了鸡S100A9在巨噬细胞中抗病毒功能及其作用机制，为今后探索S100A9基因在ALV-J致病机理中的作用奠定了基础。
2024年05期 v.32;No.161 22-26页 [查看摘要][在线阅读][下载 1450K] [阅读次数：16 ] |[下载次数：259 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] - 包玮玲;郑浩;李国新;周艳君;单同领;于海;姜一峰;高飞;虞凌雪;刘长龙;李丽薇;孔宁;童武;童光志;
已有研究表明伪狂犬经典疫苗株Bartha-K61对小鼠具有较强的致死性，为了研究伪狂犬疫苗株Bartha-K61对兔的致病性，本研究以10~3 TCID_(50)的剂量接种5只成年家兔，家兔于接种后第3 d出现死亡，并陆续在5 d内全部死亡。对病死兔进行解剖后发现大脑血管扩张及出血，心脏出现坏死以及肺部气肿、出血、坏死等典型的伪狂犬病病理变化。病理切片也显示心脏血管扩张，血管周围轻度水肿，脑部胶质细胞增生，细胞数量增多，其他各脏器也都有不同程度的病理变化。通过荧光定量PCR的方法对病死兔各组织的病毒载量进行了测定。结果表明，病死兔的各组织脏器均检测出高水平的病毒DNA，均显著高于对照组。为了进一步研究伪狂犬疫苗株Bartha-K61对家兔的致病性，本研究测定了Bartha-K61对家兔的半死致死量，结果表明：Bartha-K61对家兔的半数致死量为10~(0.3) TCID_(50)，以1×TCID_(50)的剂量接种成年家兔后，仍可引起20%的家兔致死，由此可见Bartha-K61对家兔的致死性要显著强于小鼠。因此在使用Bartha-K61过程中应针对不同物种注意生物安全控制。
2024年05期 v.32;No.161 27-32页 [查看摘要][在线阅读][下载 1473K] [阅读次数：23 ] |[下载次数：338 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] - 董妮华;陈小珺;李昱昊;孙卿;陈梦莉;周黎笋;付宁宁;邵东华;刘珂;李宗杰;邱亚峰;李蓓蓓;魏建超;马志永;
猪链球菌(Streptococcus suis,SS)是一种重要的人畜共患病原体，猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)1954年首次在英国分离鉴定，在我国和其他养猪业发达的国家已多次流行，已成为危害我国养猪业和公共卫生安全的一个重要传染病。本研究用SS2-ZY05719株按10~9、10~8、10~6 CFU腹腔注射途径人工感染健康的新西兰兔，3种剂量均可引起发病并死亡，新西兰兔临床症状明显，感染组平均体温升高1℃～2℃。同时分析了SS2在兔体各组织中的分布，结果显示，高剂量感染组出现明显的临床症状且快速死亡，感染剂量与发病程度有正相关性，对各试验组新西兰兔内脏组织进行检测发现，SS2主要集中在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑等组织中，不同组织器官中的细菌载量也存在着一定的差异，本文研究了SS2感染新西兰兔后的临床症状和各组织载菌量，为猪链球菌的防治及致病机理研究提供参考。
2024年05期 v.32;No.161 33-38页 [查看摘要][在线阅读][下载 1447K] [阅读次数：20 ] |[下载次数：364 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] - 朱琳;李维肖;汪杰;吴珏;刘海霞;米荣升;万双秀;李宗杰;
本研究通过对比分析拉布拉多巡回犬(Labrador Retriever)和比利时马里努阿犬(Belgian Malinois)的肠道菌群，旨在探寻与警犬的生长发育和工作性能相关的关键性微生物物种。采用高通量测序技术对两种警犬的肠道菌群的16S rRNA基因进行测序，然后利用生物信息学分析技术对比研究两个品种警犬肠道的微生物群落结构。通过对测序数据进行降噪分析，总共获得了1 819 499条高质量的有效序列，平均测序长度为411 bp。然后通过97%的序列相似性进行操作分类单元(OUT)聚类，总共获得了包括17个门，25个纲，67个目，122个科和122个属的细菌。首先进行Alpha多样性分析，发现拉布拉多巡回犬的肠道菌群的丰度和多样性都明显高于比利时马里努阿犬，然后再通过主坐标分析(PCoA)方法进行Beta多样性分析，发现拉布拉多巡回犬和比利时马里努阿犬的肠道菌群分别形成了不同的分类簇。物种组成分析结果表明，警犬的肠道微生物在门分类水平主要是由厚壁菌门(Firmicutes，平均占比24.33%)、梭杆菌门(Fusobacteroidetes，平均占比23.45%)、拟杆菌门(Bacteroidetes，平均占比23.29%)、变形菌门(Proteobacteria，平均占比16.06%)、放线菌门(Actinobacteria，平均占比6.65%)和弯曲杆菌门(Actinobacteria，平均占比5.19%)组成；在属分类水平则是主要由梭杆菌属(Fusobacterium，平均占比22.56%)，普氏菌属(Prevotella，平均占比12.79%)、厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum，平均占比9.23%)、巨单胞菌属(Megamonas，平均占比7.25%)和棒状杆菌属(Corynebacterium，平均占比4.88%)等组成。本研究通过高通量测序技术对比分析了两个品种警犬的肠道菌群的结构特征和物种组成，可以为开发宠物益生菌等相关产品提供研究思路和数据支持。
2024年05期 v.32;No.161 39-48页 [查看摘要][在线阅读][下载 1595K] [阅读次数：22 ] |[下载次数：276 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] - 张宝财;杨海成;多小勇;吴倩;张示杰;
经小鼠肝门静脉注射针对EmOPN的慢病毒构建OPN低表达的小鼠肝泡球蚴病治疗模型。将腹腔感染泡球蚴6月的沙鼠剖检，提取泡球蚴原头蚴，肝脏被膜下注射原头蚴法建立C57BL小鼠肝泡球蚴病模型，饲养1月后麻醉下将针对EmOPN的慢病毒Lv-EmOPN-734注射入门静脉，无菌棉按压后电凝穿刺点止血、关腹。普通环境饲养，5 d后随机选取5只小鼠取其肝脏组织，冰冻切片后在激光共聚焦显微镜下观察验证病毒是否进入泡状棘球蚴组织。慢病毒注射2月后对比肝脏及泡球蚴组织生长情况，Western blot检测OPN表达情况。结果门静脉注射慢病毒处理5 d后，慢病毒在正常肝脏组织、囊泡生发层、囊壁、囊外炎细胞层均有分布，其中生发层、囊壁分布较多。Western blot结果表明门静脉注射慢病毒2月后OPN的表达较空白对照组明显降低(P<0.01)。本研究通过门静脉注射慢病毒成功构建低表达OPN的小鼠肝泡球蚴病治疗模型，为通过调控目标蛋白表达治疗小鼠肝泡球蚴病提供建模方法。
2024年05期 v.32;No.161 49-54页 [查看摘要][在线阅读][下载 1512K] [阅读次数：13 ] |[下载次数：142 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] - 秦枫;王艳;吴植;吴双;王安平;朱善元;李金贵;唐楠楠;陈瑜悦;
本研究从性状、pH、相对密度、装量差异、微生物限度、鉴别、含量测定等方面对三七茎叶皂苷口服液(Oral liquid of saponins of stems and leaves of Panax notoginseng,LSPN)进行质量控制研究。利用薄层色谱(thin layer chromatography,TLC)法，鉴定其主要成分；利用高效液相色谱-蒸发光散射(high-performance liquid chromatography with evaporative light scattering detector,HPLC-ELSD)法，建立LSPN中人参皂苷Rb1和Rb3含量的同步分析方法。HPLC-ELSD的色谱条件：色谱柱为GL，InertSustain C_(18) 柱(5 μm，250×4.6 mm Column)；流动相为乙腈(A)-水(B)，采用梯度洗脱；进样量：10 L；人参皂苷Rb1和Rb3保留时间分别为13.264 min和15.415 min。ELSD运行参数：氮气流速为1.64 slpm，气化温度为48℃，蒸发温度为80℃。结果表明，LSPN为黄绿色的澄清液体，味苦，pH、相对密度和微生物限度均符合标准要求。人参皂苷Rb1和Rb3的检出限(limit of detection,LOD)均为10 g/mL，定量限(limit of quantitation,LOQ)均为20 g/mL，均在20～500 g/mL内线性关系良好；回归方程分别为Y=1.58X+1.72(r=0.999904)和Y=1.60X+1.64(r=0.999628)。人参皂苷Rb1和Rb3的平均加样回收率分别为101.25%和100.42%，RSD分别为2.71%和1.12%。该法准确，精密度、重现性好，可用于LSPN中人参皂苷Rb1和Rb3的含量测定。
2024年05期 v.32;No.161 55-64页 [查看摘要][在线阅读][下载 1508K] [阅读次数：15 ] |[下载次数：396 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] - 赵子惠;陈伯祥;王佳;成伟伟;杨明;李元新;
为开发一种猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)RT-CPA快速且准确的检测方法。本试验根据TGEV S基因的D序列，设计了3对引物，使用构建的重组质粒作为标准阳性对照，通过优化筛选条件并应用可视化核酸试纸条，成功建立了一种一步法TGEV RT-CPA检测方法。本实验筛选最优条件为：Mg~(2+)浓度1.0 mmol/L，dNTP浓度0.8 mmol/L，Betaine浓度1.0 mol/L，BstDNA聚合酶浓度8.0 U，反应温度63℃，反应时间60 min，AMV逆转录酶5 U。本研究的扩增产物通过凝胶电泳显示出梯形条带，证明了其对TGEV的特异性检测和重复性良好，灵敏度高达10拷贝/μL。初步应用显示，该方法与TGEV抗原快速检测试剂盒的符合率超过90%，显示了高灵敏度。TGEV RT-CPA方法免去了RNA提取和cDNA合成的步骤，能够完成一步检测，且该方法不需要特殊仪器，适用于现场快速检测TGEV，为快速诊断和防控猪传染性胃肠炎提供了新的技术选择。
2024年05期 v.32;No.161 65-71页 [查看摘要][在线阅读][下载 1369K] [阅读次数：16 ] |[下载次数：198 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] - 吉婧;朱明哲;宋新宇;印春生;单虎;刘业兵;
本研究旨在利用原核表达系统表达弓形虫GRA1蛋白并制备单克隆抗体，用于弓形虫病的诊断及GRA1蛋白功能研究。以弓形虫cDNA为模板，设计引物扩增GRA1基因片段，构建原核表达质粒，转化至BL21(DE3)感受态细胞，利用IPTG诱导表达蛋白并纯化。用纯化后的重组蛋白作为免疫原免疫小鼠制备单克隆抗体并鉴定。以制备的弓形虫GRA1单克隆抗体为一抗，FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗，优化反应条件建立弓形虫间接免疫荧光检测方法。结果表明：成功构建了原核表达质粒pET-30a(+)-TG-GRA1；SDS-PAGE结果显示，重组蛋白GRA1为可溶性表达，分子量约为27 kDa；Western blot结果显示重组蛋白GRA1可被犬弓形虫阳性血清识别，表明GRA1有良好的反应原性。成功筛选出5株单克隆细胞株，分别命名为1-B10、2-C3、2-C9、3-C11以及6-E6，并对它们进行亚型鉴定，其中2-C3、2-C9、3-C11为IgG1，1-B10、6-E6为IgM；IFA结果显示单克隆抗体具有良好的反应原性；建立了mAb 2-C9最佳稀释浓度为0.875 μg/mL、最佳孵育时间为1.5 h，FITC标记的羊抗鼠IgG最佳稀释倍数为1∶400、最佳孵育时间为1.5 h的间接免疫荧光检测方法，并对15只小鼠的肝脏组织切片进行检测，结果表明该方法可用于弓形虫动物组织切片的检测，有助于弓形虫感染的实验室诊断及弓形虫的动态分布研究。
2024年05期 v.32;No.161 72-82页 [查看摘要][在线阅读][下载 1629K] [阅读次数：14 ] |[下载次数：609 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] - 徐昭艳;姜峰;陈瑶;金鑫;陈泽良;韩小虎;
建立快速特异的蜱传塔城病毒Ⅰ型(TcTV-Ⅰ)荧光定量PCR检测方法，用于TcTV-Ⅰ的初步筛查。选用TcTV-Ⅰ糖蛋白G基因设计特异性引物以及TaqMan探针，建立实时荧光定量PCR检测方法。建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性，与TcTV-Ⅱ、新布尼来病毒(Severe fever with thrombocytopenia virus,SFTSV)、森林脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus,TBEV)、大别山病毒(Dabieshan orthohanta virus,DBSV)、阿龙山病毒(Alongshan virus,ALSV)等常见蜱传病毒均无交叉反应；标准曲线的循环阈值(Ct值)与模板拷贝数之间呈良好的线性关系，线性相关系数R~2=0.9999；具有良好的敏感性，最低检测限为1.10×10~1 copies/μL，灵敏度是常规PCR的10~3倍；具有较好的稳定性，组内和组间的变异系数均低于2%。采用本方法对辽宁、内蒙古及新疆地区的425份蜱样本就行检测，只有新疆地区的19份蜱样本呈阳性。结果表明本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有较高的特异性、敏感性和稳定性，可用于TcTV-Ⅰ的快速检测、流行病学调查和疫情监测等。
2024年05期 v.32;No.161 83-92页 [查看摘要][在线阅读][下载 1499K] [阅读次数：17 ] |[下载次数：419 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] - 董嘉文;黄允真;李林林;张俊勤;陈修邓;张志宏;李万荣;邝瑞欢;孙敏华;
2020年以来，在我国养鹅地区出现了一种由新型鹅呼肠孤病毒(Novel goose reovirus,NGRV)引起的以肝脾点状白色灶性坏死为主要病变特征的鹅传染性疾病。为了快速有效地检测NGRV，本试验针对禽呼肠孤病毒的λC基因设计引物和探针，建立了基于TaqMan探针荧光定量PCR方法，结果显示：该方法特异性强，对鹅细小病毒、坦布苏病毒、鹅圆环病毒、番鸭呼肠孤病毒、新型鸭呼肠孤病毒和鹅星状病毒等病原不存在交叉反应；该方法具有较高的敏感性，最低可检测限为56.6 拷贝/μL，比常规PCR方法敏感10倍；该方法的重复性良好，组内和组间变异系数小于2%。对37份疑似新型鹅呼肠孤病毒病的临床样品检测结果显示，荧光定量RT-PCR和RT-PCR检测出阳性样品均为13份，两者符合率为100%。测序结果表明，13份阳性样品均为NGRV。本试验成功建立了NGRV TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，为新型鹅呼肠孤病毒病的流行病学调查和防控奠定了坚实的基础。
2024年05期 v.32;No.161 93-99页 [查看摘要][在线阅读][下载 1461K] [阅读次数：12 ] |[下载次数：640 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] - 孙天聪;阿曼古丽·斯拉依;黄燕;米荣升;韩先干;龚海燕;陈兆国;
本研究旨在对微小隐孢子虫转录共激活因子ADA2的结构和功能进行生物信息学分析，对其编码基因CpADA2进行真核表达。利用在线生物信息学软件对CpADA2进行生物信息学分析，结果显示，CpADA2含有ZnF和SANT结构域，全长673个氨基酸残基，分子质量为76 kDa，属于可溶性蛋白；不含跨膜区和信号肽，但存在多样化的激酶特异性磷酸化位点；二级结构由α螺旋(36.70%)、β折叠(11.74%)和无规卷曲(51.56%)构成；三级结构中SANT结构域呈典型的α螺旋串联重复构象；互作网络模型和功能预测表明，该蛋白具有锌离子结合特性，并可能参与组蛋白乙酰化过程。以微小隐孢子虫cDNA为模板，PCR扩增得到CpADA2基因，成功构建了真核表达质粒p3×FLAG-CMV14-CpADA2，转染至293T细胞后，Western blot分析显示，转染重组质粒的细胞成功表达重组CpADA2蛋白。本研究为后续开展CpADA2的功能研究提供了基础。
2024年05期 v.32;No.161 100-108页 [查看摘要][在线阅读][下载 1678K] [阅读次数：15 ] |[下载次数：168 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] - 沈如玉;陈宗超;朱敏;牛朋飞;高崧;于圣青;
研究发现细菌Ⅸ型分泌系统(T9SS)效应分子的生物学功能具有多样性，它们参与细菌自身的生命活动或与细菌的致病性密切相关。在前期研究中我们发现鸭疫里默氏杆菌T9SS的效应分子大多具有酶活性，可能参与其生命活动或与致病性相关。为探索鸭疫里默氏杆菌T9SS分泌蛋白AS87＿RS03090的功能及其与细菌毒力的关系，本研究根据鸭疫里默氏杆菌AS87＿RS03090基因序列设计了特异性引物，并在其上、下游引物中分别添加BamHⅠ和SalⅠ酶切位点，将其克隆到pCold TF载体上构建原核表达载体，诱导表达和纯化出鸭疫里默氏杆菌AS87＿RS03090重组蛋白(rAS87＿RS03090)；本研究还利用自然转化的方式成功构建了AS87＿RS03090基因突变株Yb2Δ03090。研究结果将有助于进一步鉴定鸭疫里默氏杆菌T9SS在其致病过程中发挥的作用。
2024年05期 v.32;No.161 109-114页 [查看摘要][在线阅读][下载 1409K] [阅读次数：14 ] |[下载次数：279 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] - 张宁;赵平;刘思雨;赵硕;陈忠伟;何颖;欧阳康;卢冰霞;蒋家霞;郭旋;林昌华;赵武;黄伟坚;秦毅斌;赵凌;
为获得猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白的特异性单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb)，并鉴定其生物学特性，本研究利用RT-PCR方法扩增PDCoV-N基因，构建表达质粒，转化BL21感受态细胞获得重组大肠杆菌，诱导表达后获得PDCoV-N重组蛋白，将其进行纯化后再免疫小鼠，制备针对PDCoV-N蛋白的mAb，并进行了抗体的效价测定、免疫荧光(IFA)、Western blot、亚类的鉴定、mAb特异性的鉴定。结果，成功构建pColdⅡ-PDCoV-N重组原核表达质粒，SDS-PAGE显示重组N蛋白成功表达，分子质量约为38 kDa；经小鼠免疫、细胞融合、亚克隆筛选获得1株分泌PDCoV-N蛋白抗体的阳性杂交瘤细胞株；制备的腹水经间接ELISA方法测定抗体的效价为2.048×10~6。IFA、Western blot试验表明该mAb可以与PDCoV-N蛋白及全病毒特异性结合，亚类鉴定其亚型为IgG1，轻链为κ链。该mAb只与PDCoV反应，而与其他猪肠道病毒无交叉反应，表明本研究制备的mAb具有良好的特异性。本研究成功制备了PDCoV-N蛋白的mAb，为进一步研究PDCoV的生物学特性和诊断试剂的开发提供技术支持。
2024年05期 v.32;No.161 115-125页 [查看摘要][在线阅读][下载 1591K] [阅读次数：14 ] |[下载次数：411 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] - 司浣妍;张鸿曦;毛靖瑀;贺何鑫;王燕;吴云萍;龚静芝;黄思扬;
弓形虫病作为一种食源性人兽共患寄生虫病，严重危害公共卫生安全以及畜牧业生产。本实验选取弓形虫微线体蛋白2(Toxoplasma gondii microneme protein 2,TgMIC2)作为新的诊断靶标，构建TgMIC2重组表达质粒，并利用大肠杆菌表达系统进行表达，通过亲和层析纯化后获得重组蛋白，Western blot检测该蛋白的免疫反应性，棋盘法确定最佳抗原包被量和血清稀释度，优化反应条件后，成功建立基于重组MIC2蛋白的猫弓形虫病间接ELISA(indirect ELISA,iELISA)方法，并通过重复性、敏感性、特异性实验评价该方法，并对田间样品进行检测。结果显示，抗原最佳包被量为0.5 μg/孔，血清稀释度为1∶100，临界值为0.7130时，该方法的敏感性为81.25%，特异性为100%。批内与批间重复变异系数均低于或在10%左右，具有良好的重复性；与猫沙门菌和猫细小病毒阳性血清均无交叉反应，特异性好。使用MIC2-iELISA方法和弓形虫全裂解抗原(T.gondii whole lysis antigen,TLA)建立的iELISA方法检测扬州地区的48份田间猫血清样本，符合率为93.75%。本研究基于重组MIC2蛋白建立了一种新的间接ELISA方法，该方法可用于猫弓形虫病的初步诊断。
2024年05期 v.32;No.161 126-134页 [查看摘要][在线阅读][下载 1506K] [阅读次数：14 ] |[下载次数：390 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] - 任艳蓉;李传峰;孟春春;朱杰;赵建军;刘光清;
防御素为抗菌肽家族成员，且具有良好的抗菌抗病毒功能。由于抗生素的大量使用其作用已大大降低，而防御素具有良好的抗病毒应用前景，因此本研究将犬β防御素CBD122利用大肠杆菌表达重组蛋白rCBD122，经纯化后在体外细胞上进行抗重组水泡性口炎病毒(recombinant Vesicular stomatitis virus expressing green fluorescent protein,rVSV-GFP)和犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)活性测定，从而评价重组蛋白抗病毒效果。研究结果显示，37℃诱导5 h，IPTG浓度为0.5 mmol/L时rCBD122表达量较高，且大量表达于菌体破碎后菌液上清液，纯化后表达量为0.22 mg/mL。rCBD122抗rVSV-GFP和CDV感染活性测定结果显示，rCBD122抗VSV-GFP病毒效价为1.17×10~4 IU/mL；rCBD122抗CDV感染效价为2.34×10~4 IU/mL。rCBD122可在24 h特异性抑制CDV野毒株SD(14)7在易感细胞上的复制水平(P<0.01)，与病毒感染组相比，病毒RNA载量下降16.31倍。因此，本研究应用大肠杆菌表达系统成功表达了重组蛋白rCBD122，且其具有较好的抗病毒活性，为后续防御素作用机制研究以及新型抗病毒治疗药物研发奠定了基础。
2024年05期 v.32;No.161 135-143页 [查看摘要][在线阅读][下载 1549K] [阅读次数：13 ] |[下载次数：188 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] - 陈俊贞;李祯;张成远;袁圆圆;张乐乐;付强;史慧君;
以采集自新疆博乐某牛场腹泻牛的粪便，接种胎牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney,MDBK)，盲传15代分离牛肠道病毒(Bovine enterovirus,BEV)，使用蚀斑纯化法连续纯化5轮得到纯化病毒，并命名为BL311。使用BL311株感染MDBK细胞后，观察细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)，采用Reed-Muench法计算病毒滴度，利用理化性质检测、透射电镜观察、基因型分析及对小鼠的致病性试验鉴定BL311分离株。结果显示，BL311分离株感染MDBK细胞24 h后细胞出现变圆、破裂和脱落等致细胞病变效应，病毒滴度显著增高(P<0.05)；36 h后细胞出现大量CPE，病毒滴度极显著增高(P<0.01)。理化性质鉴定结果显示BL311分离株对有机溶剂具有一定抵抗力，紫外光照射1 h或56℃环境培养1 h可使毒株失活。电镜下观察BL311毒株为直径25～30 nm的球形颗粒，具有典型的小RNA病毒粒子形态。基因测序结果显示BL311毒株的基因全长是7514 nt，与国内报道的HY12分离株(KF748290)的同源性高达99%，属于BEV-E3型。致病性实验结果显示，BALB/c小鼠感染BL311毒株后，器官表现为肿大，且伴有出血；病理组织学观察可见组织器官炎性细胞浸润及出血。本研究分离纯化得到1株具有较强致病性的E种肠道病毒，将为新疆BEV的流行病学调查及致病机制研究提供依据。
2024年05期 v.32;No.161 144-151页 [查看摘要][在线阅读][下载 1604K] [阅读次数：13 ] |[下载次数：521 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] - 林亮亮;吴赛;汤傲星;刘春草;谈晓梅;程松;梁留存;滕耀鹏;朱世强;朱杰;李传锋;孟春春;刘光清;
本文对2015—2022年收集的25份疑似猫瘟样本进行了PCR检测和病原分离，同时还根据测定的VP2基因序列，对本文分离的FPV流行毒株与国内外参考毒株的同源性以及遗传演化进行了分析。检测结果表明，在25份可疑样本中有6份FPV阳性样品。在对其VP2基因进行测序鉴定以后，我们重点对1株在F81细胞中增殖滴度较高的FPV(SH0918株)进行了分离和鉴定，并详细研究了该毒株的生物学特性。研究结果表明，SH0918株可以在F81中良好增殖，并产生特异性致病变效应，其TCID_(50)为10~(-5.11)/0.1mL；IFA的检测结果进一步证明在感染细胞中存在FPV的特异性蛋白表达；电镜检测结果表明，纯化的细胞培养物中存在典型的FPV病毒粒子；血凝试验结果表明，FPV能够凝集猪红细胞，血凝效价为1∶32。测定的FPV SH0918株的全基因组长5124 bp；序列比对分析结果显示，本文分离的毒株与参考毒株之间的核苷酸序列同源性为98.4%～100%；进化树结果表明：本研究中的FPV分离毒株基本属于同一分支，其中SH0918株与国内分离株JN-FPV-96、TZ-FPV-112的亲缘关系较近，但与欧洲分离株以及疫苗株亲缘关系较远。本研究内容一方面丰富了我国FPV的流行病学资料，另一方面对新型猫瘟疫苗的研发也具有一定的参考价值。
2024年05期 v.32;No.161 152-161页 [查看摘要][在线阅读][下载 1621K] [阅读次数：15 ] |[下载次数：748 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] - 王更辰;任晓镤;郭雪峰;陈伟;
为了利用乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)引起的奶牛乳房炎进行科学防治，本研究通过琼脂斑点法筛选了68株LAB，得到59株有抗S.aureus效果的LAB。根据抗菌效果从强到弱，选择L-12、L-30、L-31和L-37进行抗菌物质成分分析，结果表明，L-12、L-30、L-31无细胞上清液(cell-free culture supernatant,CFCS)的抗菌物质主要是酸性物质，而L-37 CFCS的抗菌物质主要是蛋白类物质和过氧化氢。因此选择L-37对其进行分子生物学鉴定并研究其抗菌物质的理化特性，结果表明，L-37是1株植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum,L.plantarum)，其CFCS在pH值为2～6时，相对抗菌活性分别为115.34%、101.48%、55.06%、44.37%、20.23%，除pH值为3的处理组(pH值与初始CFCS相近)，其余均与对照组呈显著性差异；将L-37 CFCS分别在65℃、85℃和100℃条件下处理，处理组与对照组的相对抗菌活性之间没有显著性差异，说明L-37 CFCS具有良好的热稳定性；分别使用10种不同金属离子处理L-37 CFCS，Na~+、K~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Mn~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(3+)和Al~(3+)组的相对抗菌活性与对照组呈显著性差异，前5种金属离子产生抑制作用，后3种产生促进作用，Zn~(2+)和Fe~(2+)组的相对抗菌活性与对照组相比没有显著性差异。本研究成功筛选到1株L.plantarum L-37对S.aureus有较强的抗菌效果，并对其抗菌物质特性进行了研究，为安全防治S.aureus引起的奶牛乳房炎提供实验依据。
2024年05期 v.32;No.161 162-170页 [查看摘要][在线阅读][下载 1536K] [阅读次数：10 ] |[下载次数：520 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] - 王子怡;田芸嘉;徐焕志;刘琴;李元元;郭云海;周正斌;张仪;杨丽敏;
探讨海南省红带锥蝽中感染锥虫的分子流行特征，为锥虫病的防治提供依据。2020—2021年在海南省采集红带锥蝽，设计属通用引物，采用PCR扩增锥虫18S小亚基核糖体RNA基因(18S rDNA)，电泳阳性结果测序，阳性率的比较采用卡方检验。对阳性样本进行18S rDNA和热休克蛋白70基因(HSP70)序列比对和遗传变异分析。2020—2021年在海南昌江黎族自治县和五指山市共采集锥蝽143只，经实验室鉴定均为红带锥蝽。锥虫18S rDNA扩增，共获得51份锥虫阳性样本，锥虫阳性率为35.66%，其中五指山和昌江地区红带锥蝽锥虫阳性率分别为52.00%和26.88%。对51份18S rDNA测序分析，结果表明：海南省红带锥蝽感染锥虫分为两类，一类与Trypanosoma conorhini 18S rDNA(XR＿003828665.1)序列一致性高达100.00%；另一类与T.conorhini(XR＿003828665.1)序列一致性为95.79%左右，为T.conorhini地理株。对两类阳性样品进行HSP70扩增克隆测序获得9条阳性样品HSP70的核酸序列。构建系统发育树，结果表明：T.conorhini分为两群，一群与T.conorhini(XR＿003828665.1，AJ012411.1)亲缘关系更近，同为一个分支；另一群单独聚为一支。本次对海南省昌江、五指山两地红带锥蝽的调查显示：T.conorhini野生型阳性率为6.29%，T.conorhini地理株的阳性率为29.37%。本次调查的海南地区红带锥蝽感染的锥虫均为T.conorhini，并出现了T.conorhini地理株，且其为优势虫株。
2024年05期 v.32;No.161 171-178页 [查看摘要][在线阅读][下载 1588K] [阅读次数：15 ] |[下载次数：112 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] - 刘卓彤;毕斯琪;孟祥苗;胡燕萍;宋厚辉;杨杨;
为了深入研究牛分枝杆菌PPE13在病原-宿主相互作用中的具体机制，本研究利用慢病毒表达系统构建了PPE13稳定表达的THP-1细胞系。首先，采用分子克隆技术，以牛分枝杆菌基因组DNA为模板扩增出ppe13目的片段，构建含有ppe13片段的重组慢病毒表达质粒，将该质粒和慢病毒包装质粒转染至239T细胞中，72 h后收集病毒。然后，将获得的病毒感染THP-1细胞中，经1 μg/mL嘌呤霉素筛选获得稳定表达PPE13的细胞株THP-1/PPE13。最后，使用ELISA方法检测稳定表达细胞系中TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的情况，以验证细胞系中PPE13的生物学活性。结果显示，相较于对照细胞THP-1/Con，THP-1/PPE13中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平均显著升高。该细胞系的建立为深入研究PPE13调控细胞信号通路的功能提供了实验基础。
2024年05期 v.32;No.161 179-184页 [查看摘要][在线阅读][下载 1328K] [阅读次数：9 ] |[下载次数：133 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] - 郭佩东;宁红涯;谭磊;刘炜玮;孙英杰;仇旭升;廖瑛;丁铲;宋翠萍;
10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)功能丧失导致AKT的活化与积累，在肿瘤发生过程中起着关键作用。为了研究PTEN在禽肿瘤及病毒感染中的作用，构建PTEN基因稳定敲除的细胞株。测定PTEN基因稳定敲除细胞系的增殖能力，细胞周期，氧化应激和对细胞凋亡及其对H9N2及NDV病毒复制的影响。结果表明PTEN基因稳定敲除后促进细胞的增殖和细胞ROS上升以及抑制细胞凋亡，并且敲除PTEN促进了NDV与H9N2病毒的复制，这为后续研究PTEN功能奠定了基础。
2024年05期 v.32;No.161 185-190页 [查看摘要][在线阅读][下载 1438K] [阅读次数：10 ] |[下载次数：294 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ]