- 吴丽飞;王兆飞;王中华;高超;陈冈;严亚贤;孙建和;
为探索应用于治疗奶牛乳腺炎的噬菌体及裂解酶,从上海某奶牛场污水样品中分离、纯化金黄色葡萄球菌的裂解性噬菌体,分析其生物学特性。采用双层琼脂平板法分离、纯化噬菌体,观察噬菌斑特征;通过电镜观察噬菌体形态特征;测定其裂菌谱、最佳感染复数、一步生长曲线等生物学特性,并原核表达相关的裂解酶。结果显示:本研究分离、纯化得到一株噬菌体,命名为vB_SauM_YNP1(YNP1);透射电镜观察YNP1的头部呈二十面体结构,具有收缩性尾部,尾部的末端具有清晰的尾丝以及暴露出的尾管,属于肌尾噬菌体科;该噬菌体的潜伏期为10 min,暴发期为50 min,裂解量为71;最佳感染复数为1,能够高效裂解引起奶牛乳腺炎的MRSA菌株,可形成圆形、透明、边缘整齐的噬菌斑,效价为10~9 PFU/mL;基因组测序和比对结果表明,YNP1全基因组全长约为143.5 kb,(G+C)%含量为30.80%;YNP1的基因组中具有编码细菌细胞壁水解酶(裂解酶)的基因,通过原核表达,得到该裂解酶,命名为LysYNP1,平板裂解实验证实该裂解酶能够高效杀死奶牛乳腺炎耐药菌株。结果表明,噬菌体及裂解酶的高效裂菌特性使其在临床治疗奶牛乳腺炎方面具有广阔的应用前景。
2021年03期 v.29;No.141 1-9页 [查看摘要][在线阅读][下载 1648K] [阅读次数：1 ] |[下载次数：859 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：15 ] - 陶程琳;姚澜;王少辉;张耀东;王瑶;朱红;魏娟文;AFAYIBO Dossêh Jean Ap?tre;李涛;祁晶晶;田明星;丁铲;高崧;于圣青;
近年来抗生素的不合理使用导致细菌耐药性问题逐渐加剧,开发新型有效的抗菌制剂迫在眉睫。噬菌体及其溶菌酶具有特异性强、抗菌效力强、安全性高、筛选周期短、绿色安全及不易产生耐药等优势,可作为一种天然抗菌剂防控细菌病。为了分析广宿主谱沙门菌噬菌体SHWT1的溶菌酶抑菌活性,本文将沙门菌裂解性噬菌体SHWT1的溶菌酶lys基因克隆至表达载体pET28a(+),然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,纯化后获得了大小19 kDa、浓度为2 mg/mL的高纯度融合蛋白LysSHWT1。平板裂解实验显示,溶菌酶重组蛋白LysSHWT1对鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡伤寒沙门菌具有较好的裂解活性,裂菌圈直径分别为16、13、14、13 mm,对照组无裂解圈;裂菌谱结果显示,LysSHWT1对101株临床沙门菌株中的60株菌株存在裂解作用,未发现能裂解除沙门菌外的其他菌株;进一步研究发现,溶菌酶在EDTA的协同作用下可以展现更好的抑菌活性,使鸡白痢沙门菌SP01、鸡伤寒沙门菌SG02、鼠伤寒沙门菌SAT52、肠炎沙门菌SE12滴度显著下降(P<0.05)。本研究表明广宿主谱沙门菌噬菌体溶菌酶LysSHWT1可有效裂解沙门菌,在防控沙门菌感染方面具有潜在的应用价值。
2021年03期 v.29;No.141 10-15页 [查看摘要][在线阅读][下载 1574K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：596 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] - 王蒙;蔡雨豪;王春艳;丁田耘;张浩然;袁聪俐;
本研究选取自凝集能力不同的两株汉赛巴尔通体临床分离菌株进行巨噬细胞感染实验。采用冻融法比较两种巴尔通体菌胞内存活效率,并以免疫荧光技术观察巨噬细胞内巴尔通体吞噬体的熟化差异。结果显示:弱凝集巴尔通体菌在巨噬细胞内的胞内适应性优于强凝集反应菌株,在24 h检测周期内弱凝集反应菌株的存活效率较高;强凝集反应菌株的Rab7阳性吞噬体显著高于弱凝集巴尔通体菌株;溶酶体探针检测结果显示,强凝集反应菌株吞噬体的熟化程度也高于弱凝集反应菌株。本研究结果提示自凝集反应对巴尔通体菌抵抗巨噬细胞杀伤存在负调控作用。
2021年03期 v.29;No.141 16-21页 [查看摘要][在线阅读][下载 1723K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：107 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] - 涂春田;陈兆国;汪洋;左佳坤;米荣升;黄燕;韩先干;蒋蔚;
为了解上海市大型超市售卖鸡肉中单增李斯特菌的污染情况,本研究于2018年7月从上海市的多个超市中随机采集冷藏鸡翅样品270份,并对分离菌株的耐药性、血清型及生物被膜形成能力进行测定。通过常规细菌学和分子鉴定方法共确定38株单增李斯特菌,总分离率为14.07%;对分离株采用PCR法进行血清学分型,结果显示分离株以血清型1/2a(3a)型为主(63.16%,24/38),血清型1/2c(3c)次之(36.84%,14/38);K-B法药敏试验结果显示分离菌株对头孢曲松的耐药性最高(52.63%),对诺美沙星(18.42%)和四环素(15.79%)次之,对头孢噻吩、庆大霉素、氨苄西林和阿莫西林的耐药率较低,均为5.26%,对新霉素、大观霉素、卡那霉素和氯霉素的耐药率最低,均为2.63%;所有分离株对诺氟沙星、环丙沙星和链霉素这3种药物均敏感,13.16%分离株表现出多重耐药现象,最多可耐受6种抗生素;结晶紫染色法测定生物被膜形成能力,结果表明所有菌株均能形成生物被膜,且 84.21%(32/38)的分离菌株能形成较强生物被膜,其中1/2a(3a)和1/2c(3c)血清型分别占59.37%和40.63%。本研究结果表明上海市鸡肉源食品中单增李斯特菌污染情况比较严重,主要流行1/2a(3a)血清型,耐药模式多样且日趋严重,大多菌株具有强生物被膜形成能力,提示应进一步加强对动物源性食品中单增李斯特菌的监控,以降低食品安全问题带来的风险。
2021年03期 v.29;No.141 22-28页 [查看摘要][在线阅读][下载 1317K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：509 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] - 高晓龙;刘庆斌;李月;梅力;王英超;沈光年;郑雪莹;张启龙;秦彤;崔尚金;张玮;郭俊林;冯小宇;
为建立一种快速灵敏检测犬细小病毒的免疫层析方法,本研究将羧基化CdSe/ZnS 量子点与犬细小病毒单克隆抗体5G7共价偶联作为捕获探针,以犬细小病毒单克隆抗体8H7、羊抗鼠IgG作为检测线、质控线制备量子点免疫层析试纸条。结果显示,该试纸条灵敏度高,最低检测限为10~3 TCID_(50)/mL;特异性强,与犬瘟热病毒、犬冠状病毒、犬腺病毒1型无交叉反应;稳定性好,室温密封保存30 d,其灵敏度和特异性无变化;临床样本检测,与PCR方法符合率为94%,准确率高于商品化胶体金试纸条。综上所述,该试纸条灵敏度高、特异性强、准确率高,适用于犬细小病毒病临床快速诊断。
2021年03期 v.29;No.141 29-33页 [查看摘要][在线阅读][下载 1511K] [阅读次数：1 ] |[下载次数：506 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] - 谢怡灵;李润成;赵墩;杜丽飞;熊梦霞;宁柯铭;李双寅;黎满香;葛猛;
本研究将猪圆环病毒3型(PCV3)Cap蛋白截去核定位序列(NLS)后对应的dCap基因克隆至pET28a(+)并转入大肠杆菌BL21(DE3),得到重组菌后进行蛋白表达。采用镍离子亲和层析纯化dCap蛋白。将纯化的dCap蛋白作为抗原进行包被,建立检测PCV3抗体的间接ELISA方法,并对湖南省1175份临床血清进行检测。结果显示:dCap蛋白主要以包涵体形式表达,当以pH为10.83的碳酸盐缓冲液将纯化的dCap蛋白稀释到0.2 μg/mL并进行包被,且血清50倍稀释,酶标二抗1∶8000稀释时,ELISA的反应条件最佳,确定S/P临界值为0.270,批内及批间差异均小于10%,本方法与PCV2、CSFV、PRV和PRRSV阳性血清无交叉反应。对湖南省11个地级市的29个猪场的血清流行病学调查结果表明:PCV3抗体猪场阳性率为100%(29/29),样品总阳性率为58.64%(689/1175),但阳性样品主要集中在肥猪和母猪,且阳性率在肥猪阶段明显上升,说明猪群感染PCV3主要是在育肥阶段。
2021年03期 v.29;No.141 34-41页 [查看摘要][在线阅读][下载 1485K] [阅读次数：2 ] |[下载次数：447 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] - 李月梅;金雪梅;张守发;许应天;闫可心;相思宇;薛书江;金东春;
为建立猪附红细胞体双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法,本研究以抗猪附红细胞体单克隆抗体为捕获抗体,兔抗猪附红细胞体多克隆抗体为检测抗体,优化工作条件,建立猪附红细胞体DAS-ELISA检测方法。结果显示:该方法的最佳工作条件为:捕获抗体包被浓度为5.42 g/mL,检测抗体浓度为6.84 g/mL,酶标二抗的稀释倍数为1∶2000;判定标准为:当检测样品OD_(492)>0.290为阳性;该方法与弓形虫、猪链球菌、猪肺炎支原体和猪繁殖与呼吸综合症病毒等常见猪病原微生物均无交叉反应,特异性好,敏感度可达3.25 mg/L,其重复性变异系数均小于10%;平行检测68份猪临床样品,DAS-ELISA检测的阳性率为29.4%,比血涂片染色镜检阳性率(19.1%)高10.3%。本研究所建立的猪附红细胞体DAS-ELISA检测方法可以作为猪附红细胞体的快速检测方法。
2021年03期 v.29;No.141 42-46页 [查看摘要][在线阅读][下载 1142K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：366 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] - 赵磊;刘畅;刘欣超;王旋;黄佳佳;阮来田;张训海;
为建立快速检测Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-I)血清型通用PCR方法,根据FAdV-Ⅰ12个血清型基因保守区设计引物,建立了二温式PCR和VPCR方法。结果显示:本研究建立的FAdV-Ⅰ二温式PCR方法,在90℃～94℃变性3 s、70℃～74℃退火兼延伸8 s,循环35～40次时,最快可在15 min内完成扩增;对分属5个种的5个血清型毒株检测都呈阳性,对EDSV、NDV、沙门菌等12种禽常见病原核酸检测呈阴性;最低检测质粒拷贝数为13.9 copies/μL,最低检测病毒滴度为10~(0.3) EID_(50)/0.1 mL;对源于FAdV-4感染致死SPF鸡的心脏、肝脏、脾脏等14种样品核酸提取物检测均为阳性。建立的VPCR,在92℃变性0 s、70℃退火延伸0 s,40次循环时,可23 min完成,其最低检测质粒拷贝数亦为13.9 copies/μL;对150份采集自安徽省部分地区样品及送检病料的检测与分析显示,所建立的二温式PCR和VPCR总阳性检出均率为30.7%,其符合率为100%。本研究表明,所建立的通用型二温式PCR和VPCR方法,均可用于Ⅰ群FAdV的快速检测与鉴定。
2021年03期 v.29;No.141 47-55页 [查看摘要][在线阅读][下载 1509K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：281 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] - 党佳佳;卢丽飞;赵硕;许力士;吴青萍;黄伟坚;
为了解2017-2019年广西猪伪狂犬病病毒(PRV)的流行和遗传变异情况,对2017年1月至2019年8月于广西各地区采集的284份疑似伪狂犬病发病猪临床样品进行检测和病毒分离,对分离毒株的gC、gG基因进行克隆、测序、遗传变异分析。被测样品中有85份阳性,阳性率为29.9%,从中共分离到10株PRV毒株,其中9株为国内变异毒株,1株为国内经典毒株。结果显示:广西地区流行的不同亚型PRV毒株在gC、gG基因上均存在相似的核苷酸和氨基酸变异特点,主要与国内变异株亲缘关系较近;广西地区PRV流行毒株主要为国内变异株。本研究结果丰富了广西PRV检测数据资料,为深入评估和预测广西PRV疫病的流行情况提供了可靠的数据基础。
2021年03期 v.29;No.141 56-63页 [查看摘要][在线阅读][下载 3360K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：248 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] - 范前进;刘秋歌;石达;王潇博;张家林;汤荣锋;陈建飞;冯力;
为制备猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)S蛋白的单克隆抗体,本研究首先优化、合成了PDCoV NH株的S基因,利用PCR方法从中扩增S基因片段,克隆至pAAV-IRES-hrGFP真核表达载体,构建真核表达质粒pAAV-NH-S-Flag,转染至HEK293T细胞中进行表达。采用EZview Red ANTI-FLAG M2亲和凝胶蛋白纯化试剂盒进行纯化重组蛋白。将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾脏B淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,利用Western blot和IFA鉴定单克隆抗体的特异性。结果显示:筛选获得两株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株17C7和23F3,单克隆抗体的亚型均为IgM,腹水效价均为1∶6400;两株单克隆抗体都与S蛋白有良好的反应性,且能够与PDCoV发生特异性反应,而与其他常见的猪腹泻冠状病毒不发生反应。本研究为PDCoV诊断及病毒入侵、感染机制的研究奠定了基础。
2021年03期 v.29;No.141 64-70页 [查看摘要][在线阅读][下载 2000K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：836 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：14 ] - 尚原冰;祁晶晶;王宇;李浩然;刘晓涵;王少辉;李涛;田明星;于圣青;周铁忠;
磷酸甘油酸激酶(PGK)是生物进行糖酵解的关键酶,目前未见关于鸡滑液支原体(MS)PGK的相关研究报道。本实验采用Overlap PCR方法对MS的pgk基因进行点突变扩增,然后连接至pET-28a(+)表达载体并在大肠杆菌BL21中表达,纯化获得重组MSPGK(rMSPGK)蛋白,然后对纯化后的rMSPGK蛋白的酶学活性进行测定,包括温度、pH及不同底物对酶活的影响,并计算其酶比活力、米氏常数及最大反应速率。结果显示:最终获得了纯化的rMSPGK蛋白,其相对分子质量约为45 kDa;酶学活性测定显示,rMSPGK蛋白的酶比活力为100.70 IU/mg,最适酶促温度为37℃,最适pH为7.5;双倒数法求得rMSPGK蛋白相对于3-PGA的最大反应速率V_(max)为370.37 μmol/(L?min),米氏常数K_m值为3.88 mmol/L;相对于ATP的最大反应速率V_(max)为357.14 μmol/(L?min),K_m值为0.25 mmol/L。综上,本实验成功地表达了MS的PGK蛋白,并获得了酶活力较高的rMSPGK蛋白,为进一步研究鸡滑液支原体代谢和致病机制奠定了基础。
2021年03期 v.29;No.141 71-79页 [查看摘要][在线阅读][下载 1958K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：365 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] - 张璐;康棣;高闪电;田占成;关贵全;刘光远;罗建勋;殷宏;独军政;
本研究通过对蓝舌病病毒1型(BTV1)的NS1基因进行抗原性分析,选取其中抗原指数较高的片段(1～960 bp),利用RT-PCR 扩增获得NS1截短基因序列,插入原核表达载体pET-30a中构建重组表达质粒pET-NS1-320aa,将该重组质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达并进行可溶性分析,利用SDS-PAGE对截短NS1蛋白的表达进行检测,发现重组NS1蛋白主要以包涵体的形式存在于菌体中。利用组氨酸标签纯化树脂获得了高纯度的NS1蛋白;将其免疫新西兰大白兔制备的抗NS1多克隆抗体不仅可与重组表达的截短NS1蛋白反应,而且可与BTV1感染细胞中的天然NS1蛋白发生特异性反应;免疫荧光实验发现在BTV1感染的BHK-21细胞中检测到了NS1蛋白的特异表达,且分布于细胞质中。本研究成功表达了BTV重组NS1截短蛋白并制备了相应的特异性抗体,为研究 NS1 蛋白的特性和功能奠定了基础。
2021年03期 v.29;No.141 80-86页 [查看摘要][在线阅读][下载 1755K] [阅读次数：1 ] |[下载次数：512 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] - 傅欣玲;张聪;张纹纹;李文良;杨蕾蕾;毛立;李基棕;江杰元;
裂谷热(RVF)是由裂谷热病毒(RVFV)引起的一种人兽共患传染病,主要由蚊媒传播。该病主要感染反刍动物,可引起流产和新生胎儿死亡,人类对该病也易感,严重者可导致死亡。对于无RVF的国家,建立相应的病原学与血清学检测方法对于防止该病传入至关重要。为了建立基于病毒N蛋白的诊断技术,本研究构建了裂谷热病毒N基因原核表达质粒pET-28a-N,转化BL21 (DE3),IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot检测蛋白的表达,重组蛋白分子量约为29 kDa,主要以上清液形式存在。大量表达并纯化重组蛋白,用纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,并对其进行鉴定。采用间接ELISA和ID Vet公司阻断ELISA试剂盒检测免疫小鼠抗体效价及特异性,并用Western blot检测多克隆抗体反应性。结果表明,免疫后的抗体效价迅速升高,最终可达51 200以上;阻断ELISA和Western blot检测结果表明,制备的多克隆抗体具有良好的反应性与特异性。通过3次亚克隆最终获得2株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分泌的单克隆抗体均可与重组蛋白反应,重链均为IgG2a型,轻链为κ型。本研究为RVF诊断方法的建立奠定了基础。
2021年03期 v.29;No.141 87-92页 [查看摘要][在线阅读][下载 1419K] [阅读次数：4 ] |[下载次数：312 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] - 方文秀;谭磊;孙英杰;宋翠萍;刘炜玮;廖瑛;丁铲;仇旭升;吴艳涛;
CD150蛋白是副黏病毒的重要受体,能够促进病毒与宿主细胞结合并感染。本研究旨在克隆鸡CD150基因后进行原核表达,并对获得的氨基酸序列进行详细分析,为后续基因功能研究奠定基础。从原代鸡胚成纤维细胞(CEF)中扩增得到CD150 CDS序列,将其克隆入pMD19-T载体中进行测序鉴定,将其在pET-28b原核表达载体中表达,并制备多克隆抗体,最后,通过生物信息学软件对CD150进行氨基酸序列分析。结果显示:成功克隆大小为999 bp的鸡CD150基因;鸡CD150蛋白以包涵体形式表达;所制备的多克隆抗体能够特异性结合鸡淋巴细胞表面的CD150蛋白;二级结构中α-螺旋占25.83%,β-折叠占23.42%,无规则卷曲占50.75%;跨膜区分析可知,CD150蛋白包括胞外区、胞内区和跨膜区;三级结构以β-折叠为主,包括V和C2两个结构域,不同物种V结构域中存在7个完全保守的氨基酸位点。本研究成功克隆、表达了鸡CD150蛋白,并制备多克隆抗体,为鸡CD150蛋白生物学功能研究检测及其在鸡组织中的表达和分布提供数据支持。
2021年03期 v.29;No.141 93-100页 [查看摘要][在线阅读][下载 3374K] [阅读次数：0 ] |[下载次数：190 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ]